转录抑制因子锌指蛋白57在前列腺癌组织中的表达

顾 珺，王 静

(上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092)

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，远处转移是患者死亡的首要原因[1]，目前临床仍缺少有效的治疗方案，前列腺癌患者5 a生存率低于30%[2].由于我国前列腺癌早期筛查尚未普及，患者确诊时多已处于晚期，治疗预后差[3].近年来，随着分子生物学和基因组学技术的快速发展，对恶性肿瘤的研究也进入到基因和蛋白层面，寻找参与前列腺癌发生与发展过程中的调控蛋白，对病情评估和靶向治疗具有重要意义[4].转录抑制因子锌指蛋白57(ZFP57)在乳腺癌和卵巢癌组织中均呈低表达，预示预后不良[5-6].但ZFP57在前列腺癌发生与发展中的调控作用目前仍未见系统报道.本研究检测了前列腺癌组织、癌旁组织、良性增生组织、正常前列腺组织中ZFP57表达水平，并探讨不同病理特征的前列腺癌患者中ZFP57的表达特点.

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2017年8月—2019年6月上海交通大学医学院附属新华医院行前列腺穿刺活检的石蜡包埋组织标本，其中，前列腺癌组织92例，癌旁组织24例，良性增生组织24例，正常前列腺组织24例.前列腺癌患者年龄54～82岁，平均(69.61±6.35)岁；TNM分期：T1期14例，T2期32例，T3期22例，T4期24例；Gleason评分：2～4分24例，5～7分46例，≥8分22例；转移情况：有24例，无68例；术前前列腺癌特异性抗原(Prostate-specific antigen，ρ(PSA)≤20 ng/mL 50例，>20 ng/mL 42例.本研究经医院医学伦理委员会批准，标本使用经患者同意.

1.2 主要试剂

ZFP57免疫组化鉴定试剂盒(DRG公司，美国)；石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒(亚太恒信生物科技(北京)有限公司)；BCA蛋白检测试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术公司)；鼠抗人ZFP57单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体、IgG二抗(Epitomics公司，美国).

1.3 方 法

1.3.1 免疫组化检测

取组织标本，4 μm连续切片，脱蜡至水，使用3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶活性，修复抗原.滴加一抗(鼠抗人ZFP57单克隆抗体，1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；次日使用磷酸缓冲液冲洗3次，滴加二抗(1∶2 000稀释)，室温静置2 h，磷酸缓冲液冲洗3次，DAB显色，苏木素复染，树胶封片.由2位高级职称病理医师对结果进行判断.光学显微镜下选取5个视野，每个视野计数200个细胞，黄色或棕黄色颗粒为阳性.半定量分析标准：无阳性细胞赋0分，阳性细胞比例<25%赋1分，25%～50%赋2分，>50%赋3分；无染色赋0分，淡黄色赋1分，黄色赋2分，棕黄色赋3分.计算阳性细胞比例和染色强度：0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为中等阳性，5～6分为强阳性.

1.3.2 Western blot检测

使用石蜡包埋组织蛋白试剂盒提取石蜡包埋组织标本中的总蛋白，BCA法蛋白定量，电泳、转膜至PVDF(0.45 μm 孔径)；将膜放在含5%脱脂奶粉的TBST平皿中，室温下封闭1 h，滴加鼠抗人ZFP57单克隆抗体(1∶1 000稀释)、鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶2 000稀释)，4 ℃过夜；次日使用磷酸缓冲液冲洗3次，滴加二抗(1∶2 000稀释)，室温静置2 h；磷酸缓冲液冲洗3次，ECL显色，暗室中显影；采集图像，分析灰度值，计算ZFP57蛋白的相对表达量.

1.3.3 临床指标收集

通过医院的电子病历系统，收集前列腺癌患者的TNM分期、格里森(Gleason)评分、转移情况、PSA水平，分析这些指标与ZFP57表达的关系.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 不同组织中ZFP57表达的免疫组化分析

免疫组化染色显示：正常前列腺组织、良性增生组织、癌旁组织中均可见细胞内大量黄色或棕黄色染色，前列腺癌组细胞内仅存在少量黄色或棕黄色染色.半定量分析显示：前列腺癌组织中ZFP57阳性率明显低于本研究中其他组织标本，差异具有统计学意义(P<0.01)；ZFP57阳性率在正常前列腺组织、良性增生组织、癌旁组织间比较差异无统计学意义(P>0.05).见图1、表1.

表1 ZFP57在不同组织中阳性表达情况分析

2.2 不同组织中ZFP57表达的Western blot分析

从不同前列腺组织中分别选取10例进行Western blot检测，结果显示：前列腺癌组织中ZFP57相对表达量明显低于正常前列腺组织、良性增生组织、癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.01).见图2、表2.

表2 不同组织中ZFP57相对表达量

2.3 ZFP57表达与前列腺癌患者病理特征的关系

不同TNM分期、Gleason评分、转移情况、PSA水平在前列腺癌患者ZFP57阳性率之间比较差异均具有统计学意义(P<0.01)，其中，TNM分期增加、Gleason评分增加、癌细胞转移、ρ(PSA)>20 ng/mL的前列腺癌患者ZFP57阳性率明显降低.见表3.

表3 不同病理特征的前列腺癌患者ZFP57阳性率

3 讨 论

美国国家癌症研究所统计[7]显示：前列腺癌是排第2位的致死性恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌.近年来，我国的前列腺癌发病率明显升高[8],流行病学调查[9]显示：前列腺癌发病率年增速超过4%，死亡率年增加超过6%.TNM分期、Gleason评分、PSA水平是临床评估前列腺癌严重程度的主要参考指标，能够较好地判断病情的严重程度并预测预后水平[10]，但临床仍缺少针对前列腺癌的有效治疗方案，导致患者死亡率高.探索参与前列腺癌发生与发展的相关蛋白，对发现新的治疗靶点、改善临床预后具有重要意义.

转录抑制因子ZFP57具有高度保守的结构序列，参与介导脊椎动物的神经发育[11-13].相关研究[14]显示：大鼠胚胎发育过程中ZFP57基因突变会导致全前脑畸形；ZFP57基因还参与调节小鼠神经嵴的形成过程.还有研究[15]发现：在乳腺癌中，ZFP57发挥抑癌基因作用，表达下调与患者不良预后密切相关；卵巢癌中ZFP57表达水平明显降低，上调ZFP57表达能够通过激活Hh信号通路，抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移.但ZFP57在前列腺癌组织中的表达和作用仍未见系统报道.本研究显示：前列腺癌组织中ZFP57阳性率明显低于正常前列腺组织、良性增生组织、癌旁组织；ZFP57相对表达量亦明显低于正常前列腺组织、良性增生组织、癌旁组织.从免疫组化半定量和Western blot定量检测均得出：前列腺癌组织中ZFP57表达水平明显降低，提示ZFP57可能在前列腺癌发生与发展过程中发挥抑癌基因作用，与上述研究中ZFP57是乳腺癌和卵巢癌抑癌基因的结论一致.

TNM分期是目前临床认可度最高的肿瘤分期系统，分期越高反映肿瘤进展程度越严重[16].Gleason评分与前列腺癌组织的生理功能和治疗预后存在相关性，且重复率良好，是临床治疗方案制定的主要参考指标之一[17]；Gleason评分越高提示肿瘤分化程度越低，恶性程度更高[18].PSA由前列腺上皮细胞分泌，有稀释精液的作用，仅极低水平存在于外周血中[19-20]；当前列腺出现病理性改变时，血清PSA浓度迅速上升，作为一种肿瘤标志物广泛用于前列腺癌的筛查，在患者病情评估中也具有重要的参考价值[21].本研究显示：TNM分期增加、Gleason评分增加、癌细胞转移、ρ(PSA)>20 ng/mL的前列腺癌患者ZFP57阳性率明显降低，提示ZFP57表达水平与前列腺癌患者TNM分期、Gleason评分、癌细胞转移情况和PSA水平呈负相关，可用于评估患者的预后水平.

综上所述，前列腺癌组织中转录抑制因子ZFP57呈低表达，且与临床病理指标呈负相关，提示ZFP57作为抑癌基因参与前列腺癌的病理过程，但具体分子机制仍需进一步的探讨.