曲 萌,侯勤龙,翁诗雅,高润泽,宋 宇,董志恒
(北华大学医学院,吉林 吉林 132013)
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是导致终末期肾衰竭及糖尿病患者死亡的重要原因,其发病机制复杂,与氧化应激、细胞增殖、炎症反应、糖脂代谢紊乱、遗传易感性等多种因素密切相关[1-3].DN的主要病理改变为肾脏纤维化,临床表现为肾小球硬化和肾小管间质纤维化.有研究[4]表明,炎症因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)在糖尿病的炎症反应及肾间质纤维化中具有关键作用.肾小球系膜细胞(glomerulus mesangial,GMC)作为DN的主要靶细胞,在高糖的刺激下,会由静息状态转为增殖活化状态,同时分泌大量细胞因子,合成大量的系膜基质,表现为肾小球肥大、肾小球基膜增厚和细胞外基质(ECM)积聚,导致肾小球硬化的发生[5].故探讨抑制系膜细胞增生及减轻炎症反应的药物,对延缓DN的发生、发展具有重要的临床意义.
玉米须多糖(Stigma maydis polysaccharide,SMP)是玉米须中主要的水溶性成分,由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖组成[6],具有降脂降糖、抗疲劳、抗氧化等多种药用活性[7-8],但其对高糖下大鼠GMC增殖及炎症因子表达的影响尚未见报道.本研究以大鼠GMC株HBZY-1为研究对象,观察SMP对高糖诱导下大鼠HBZY-1细胞增殖、炎症因子MCP-1、IL-6在基因及蛋白水平表达的影响,旨在探讨玉米须多糖对糖尿病肾病的防治作用及可能机制.
正常大鼠GMC株(HBZY-1,中国医学科学院基础医学研究所细胞中心);兔抗MCP-1、IL-6多克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体、ECL增强发光试剂盒(Santa Cruz公司,美国);抗兔二抗、抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;荧光实时定量PCR试剂盒(上海睿铂赛生物技术有限公司);玉米须多糖(吉林大学药学院提供);其他试剂均为国产分析纯.
1.2.1 HBZY-1细胞培养与分组
从液氮中取出HBZY-1细胞冻存管后,迅速复苏,接种于含15%胎牛血清(FBS)的DMEM低糖培养基中,5% CO2,37 ℃培养,24 h半量换液,以后每2~3 d完全更换培养液1次,换液过程中逐渐将FBS浓度降为10%,待细胞长满至平底后用0.25%胰酶消化,进行细胞传代.对对数生长期的细胞进行分组处理:正常对照组(NG组,DMEM低糖培养液培养),高糖组(HG组,25.0 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培液培养),高糖+玉米须多糖35 μg/mL组(低剂量组,SMP35组),高糖+玉米须多糖70 μg/mL组(高剂量组,SMP70组).
1.2.2 MTT法检测不同培养条件下HBZY-1细胞的增殖
取5代HBZY-1细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养液以1×104/mL接种于96孔板中,贴壁后同步化(含0.5%FBS的DMEM低糖培养液)24 h,按组别加入相应培养条件,每组设5个复孔,继续培养24、48、72 h.在预定时间点,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,37 ℃继续孵育4 h,弃去孔内上清,每孔加入150 μL DMSO,震荡溶解结晶物10 min,在酶标仪490 nm处检测各孔吸光度值,以吸光度值表示各组HBZY-1细胞的增殖.
1.2.3 RT-qPCR法检测HBZY-1细胞中MCP-1、IL-6 mRNA表达
Trizol提取总RNA,反转录合成cDNA后进行定量PCR扩增.反应体系:cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL,总体积20 μL,反应条件:95 ℃预变性10 min,(95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s)× 40循环,每个样本设5个复孔.引物序列为:MCP-1上游引物5′-CCAGAAAC CAGCCAACTCTC-3′,下游引物5′-TGAGGTGGTTGT GGAAAAGA-3′;IL-6上游引物5′-AGTTGCCTTCTTG GGACTGA-3′,下游引物5′-GAGCATTGGAAGTTGG GGTA-3′;GAPDH上游引物5′-ACAGCAACAGGGTG GTGGAC-3′,下游引物5′-TTTGAGGGTGCAGCGAA CTT-3′.采用2-ΔΔCT法计算各实验组HBZY-1中目的基因mRNA含量,若2-ΔΔCT>1,则提示目的基因表达量升高,若2-ΔΔCT<1,则提示目的基因表达量下降.
1.2.4 Western Blot法检测HBZY-1细胞中MCP-1、IL-6蛋白表达
各实验组作用48 h后,收集细胞,每组样品各加50 μL蛋白裂解液,4 ℃ 2 h,10 000 r/min 离心5 min,留上清,测定浓度,定量后加入上样缓冲液,煮沸5 min,使其变性.各取50 μg蛋白样品上样,10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜,含5% 脱脂奶粉封闭1 h.按说明书所示比例将一抗加入封闭液中,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后加入相应二抗,37 ℃孵育2 h,TBST洗膜,ECL增强发光试剂盒A、B液1∶1显色处理,ECL发光仪进行图像采集及数据处理.蛋白表达水平=每个样本条带的吸光度值/β-actin的吸光度值.
MTT检测结果显示:与NG组比较,细胞培养24 h后,HG组HBZY-1细胞增殖加快(P<0.01),48 h后,高糖促进HBZY-1细胞增殖的作用更为显著;SMP35组HBZY-1细胞增殖均显著加快(P<0.01或P<0.05),SMP70组24 h时增殖显著加快(P<0.05),48 h时与NG组无显著性差异.与HG组比较,SMP干预组HBZY-1细胞增殖均有显著性降低(P<0.01),且呈浓度依赖关系,同时,随着时间的延长,抑制效果越为显著.细胞培养72 h后,高糖对HBZY-1细胞的增殖开始呈现抑制作用,各组数据比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.
表1 不同浓度的SMP对HBZY-1细胞增殖的影响
研究[9-10]表明:高糖可促进DN患者MCP-1表达,而局部组织中MCP-1表达增加可使炎症状态延长,导致肾组织损伤.本实验结果显示:在mRNA水平上,各高糖组MCP-1 mRNA的基因表达丰度均高于NG组(P<0.01),其中HG组比NG组高3.04倍;两个SMP干预组与HG组比较均呈显著下降(P<0.01或P<0.05).见图1.在蛋白水平方面,MCP-1在NG组HBZY-1细胞中表达量较低(0.24±0.03),与NG组比较,高糖诱导48 h后MCP-1表达上调(P<0.01或P<0.05);与HG组(0.72±0.06)比较,两个SMP干预组MCP-1表达均显著下调(P<0.01),其中SMP70组下调更为显著,但两SMP干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05).见图2.提示,质量浓度为35~70 μg/mL的SMP在基因及蛋白水平均可显著下调高糖诱导下HBZY-1细胞中MCP-1的表达.
在高糖环境下,DN患者IL-6的表达水平较高,且血清IL-6含量与患者的尿蛋白排泄率呈正相关[10].本研究RT-qPCR检测结果显示:高糖刺激48 h后,HBZY-1细胞中IL-6 mRNA表达上调,与HG组比较,SMP35组和SMP70组IL-6 mRNA表达显著下调(P<0.01或P<0.05),且呈剂量依赖关系.见图3.我们进一步应用Western Blot法检测了IL-6蛋白表达,各实验组HBZY-1细胞中IL-6蛋白表达与mRNA表达趋势相似,具体表现:与NG组(0.20±0.04)比较,HG组显著增高(P<0.01);与HG组(0.85±0.07)比较,两个SMP干预组IL-6蛋白表达均显著下调(P<0.01或P<0.05).见图4.
在糖尿病肾病(DN)中,肾小球系膜细胞(GMC)是多种致病因素作用的主要靶细胞.正常生理条件下,GMC几乎不增殖,但高糖可诱导其发生异常增殖[11],成为最活跃的肾固有细胞,这在本实验中亦得到了证实.增殖的GMC通过分泌大量的细胞外基质及伸入肾小球中使其发生狭窄甚至闭塞,进而导致肾小球硬化的发生.长期的慢性微炎症与GMC的过度增殖密切相关,加速DN的发生发展[12],其中被广泛认可的炎症因子有白介素(IL)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子受体-α(TNF-α)等[13-14].
MCP-1又称趋化因子配体2(CCL2),是趋化因子家族中的小细胞因子,具有趋化和激活单核巨噬细胞的功能,后者浸润肾组织,产生氧自由基、一氧化氮合酶、IL-8、转化生长因子等[15],从而造成血管内皮细胞损伤,促进肾小球纤维化.有研究[16-17]表明:在DN患者及DN动物模型的肾组织中,MCP-1水平明显升高,同时,DN患者血清和尿液中MCP-1含量也增加,其水平与DN的临床阶段相关,即在DN微量蛋白尿期出现显著升高,随着病程进展,尿微量白蛋白也增加.通过对MCP-1缺乏的小鼠观察发现[18],STZ诱导的糖尿病(DM)小鼠肾组织中巨噬细胞浸润减少,糖尿病肾损伤的进展延缓.可见,MCP-1在DN进展中起关键作用,抑制MCP-1信号传导可能是治疗DN的重要靶标.在本实验中,与NG组比较,各高糖组MCP-1在mRNA和蛋白水平的表达均升高,这与WINTER L等[9]和SU H等[10]的研究的结果相一致.
有研究[17-19]证实:在DN大鼠模型中,肾皮质及尿液中IL-6水平均显著增加,与无肾病的DM患者比较,DN患者血清中IL-6水平增高,IL-6的增加程度与肾损伤程度呈正相关.在本实验中,与正常对照组比较,高糖模型组HBZY-1细胞中IL-6显著增加.作为炎性因子,IL-6导致肾小球滤过膜通透性异常、系膜细胞发生肿胀、纤维连接蛋白表达上调,可见,IL-6水平检测亦可作为DN进展的重要标志.
玉米须是禾本科植物玉米的干燥花柱和柱头,是传统中医常用药物之一.玉米须性甘味平,具有利水消肿、利湿退黄的功效,临床上主要用于消渴、水肿、眩晕等症状的治疗,对人体无急、慢性毒副作用.玉米须多糖(SMP)是玉米须水提产物,大部分是由戊糖和己糖聚合而成.有报道[20-22]显示:SMP不仅能显著降低STZ诱导的DM动物模型的血糖,还显著降低肾脏指数、24 h尿蛋白、血清中总胆固醇和甘油三酯等指标的水平,其降糖效果呈现量效关系,其中高剂量组与二甲双胍治疗效果相当.此外,玉米须的水提物可抑制肾组织中TGF-β1的表达,下调纤维连接蛋白的合成,减轻细胞外基质的过度聚积,从而延缓DN的进一步发展[23].
本实验采用了高、低两个剂量的SMP干预高糖下大鼠GMC株HBZY-1的培养,结果显示:35~70 μg/mL的SMP可在一定程度上抑制高糖诱导的HBZY-1细胞的过度增殖(P<0.01),且呈现浓度依赖关系.我们通过mRNA和蛋白水平进一步观察不同浓度的SMP对高糖下HBZY-1中炎症因子MCP-1、IL-6含量的影响,结果显示:与HG组比较,高、低剂量SMP干预组均可显著下调MCP-1、IL-6的表达(P<0.01或P<0.05).SMP对HBZY-1细胞增殖的抑制作用及对炎症因子MCP-1、IL-6的下调作用的结果提示,一定浓度的SMP可在一定程度下保护高糖下的HBZY-1细胞,并具有潜在的DN防治作用,但其具体作用机制有待进一步深入研究.
致谢:本文是国家级大学生创新创业训练计划项目研究成果的一部分,北华大学医学院15级学生张娜娜、郭萌颖,18级学生尹含钰、郑鸿、王思琪参加了本实验工作,在此表示感谢.