全蝎白术白头翁组方发酵前后萃取工艺及体外抗肿瘤活性研究

陶然　王娅玲　李佳怿　刘富菁　陈美琦　王集会　张珊珊

摘      要： 為了研究全蝎白术白头翁组方（SAPZF）发酵前后最佳萃取部位，采用球孢白僵菌双向固体发酵技术制备全蝎白术白头翁组方发酵物（SAPZFFW），分别制取组方发酵前后的质量分数75%醇提液。采用系统萃取法，制得SAPZFFW、SAPZF的石油醚部、乙酸乙酯部、正丁醇部、水部干浸膏。通过MTT法检测SAPZFFW、SAPZF不同极性部位对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用。结果表明：SAPZF有效部位的抗肿瘤能力由大到小依次为，石油醚部、正丁醇部、乙酸乙酯部;SAPZFFW有效部位抗肿瘤能力由大到小依次为，正丁醇部、石油醚部、乙酸乙酯部;SAPZFFW对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用优于SAPZF，且正丁醇部效果较好。

关  键  词：全蝎白术白头翁;系统萃取法;极性部位;发酵;乳腺癌细胞株MCF-7

中图分类号：R284.2          文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）06-1154-04

Study on Extraction Technology of Scorpio， Atractylodes Macrocephalae Rhizoma and Radix Pulsatillae Prescription Before and After Fermentation

TAO Ran¹， WANG Ya-ling¹， LI Jia-yi¹， LIU Fu-jing¹ ， CHEN Mei-qi²， WANG Ji-hui³， ZHANG Shan-shan³

（1. School of Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China;

2. College of traditional Chinese Medicine， Shandong University of traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China;

3. Experimental Center， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： In order tostudy the optimum extraction site of Scorpio， Atractylodes Macrocephalae Rhizoma and Radix Pulsatillae Prescription （SAPZF） before and after fermentation， SAPZFFW （fermentation product of SAPZF） was prepared by the two-way solid fermentation of Beauveria bassiana.The 75% alcohol extract of the SAPZFFW and SAPZF were subsequently obtained.Their dry extracts of petroleum ether part， ethyl acetate part， n-butanol part and water part were prepared by system extraction， respectively. Their inhibitions on breast cancer cell line MCF-7 were assayed by MTT for different polar sites. The anti-tumor ability of SAPZF effective site in order from large to small was determined as follows： petroleum ether part > n-butanol part > ethyl acetate part. That of SAPZFFW was determined as follows： n-butanol part > petroleum ether part > ethyl acetate part. The inhibitory effect of SAPZFFW on breast cancer cell line MCF-7 was better than that of SAPZF， and the effect of n-butylalcohol part was better.

Key words： Scorpio; Atractylodes macrocephalae rhizoma and radix pulsatillae; System extraction; Polar region; Fermentation;breast cancer cell line MCF-7

2.4  数据处理

数据均用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析的基础上的q检验。p<0.01表示有极显著性差异，p<0.05表示有显著性差异。

3  结果

3.1  SAPZF不同极性部位对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用

由图1可知，在供试药液质量浓度0.03～0.50 mg·mL^-1范围内，SAPZF的乙酸乙酯部与水部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制率均较低，乙酸乙酯部只有在质量浓度达到0.25 mg·mL^-1以上时其抑制率才开始逐渐上升至47%左右，水部抑制率基本在10%上下徘徊，而SAPZF的石油醚部與正丁醇部均呈现一定的量效关系。当质量浓度为0.25 mg·mL^-1时，石油醚部的抑制率达到最高（89.88%）;当质量浓度为0.50 mg·mL^-1时，正丁醇部的抑制率达到最高（87.67%）。

由此可知，水部对乳腺癌细胞株MCF-7几乎无抑制作用，石油醚部、正丁醇部、乙酸乙酯部均为SAPZF抗肿瘤的有效部位，且抗肿瘤能力由大到小依次为：石油醚部、正丁醇部、乙酸乙酯部。

3.2  SAPZFFW不同极性部位对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用

由图2可知，在供试药液质量浓度0.03～0.50 mg·mL^-1范围内，SAPZFFW的水部对乳腺癌细胞株MCF-7几乎无抑制作用，而SAPZFFW的石油醚部、乙酸乙酯部以及正丁醇部表现出较强的抗肿瘤活性。尤其是正丁醇部，在各试验药物浓度下，均表现出极强的抗肿瘤活性，对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制率最高可达95.24%。由此可知，石油醚部、乙酸乙酯部以及正丁醇部均为SAPZFFW抗肿瘤的有效部位，且抗肿瘤能力由大到小依次为：正丁醇部、石油醚部、乙酸乙酯部。

3.3  SAPZFFW、SAPZF有效部位显著性分析

3.3.1  SAPZFFW、SAPZF醇提物石油醚部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF与SAPZFFW石油醚部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见图3。当试验药物质量浓度为0.03、0.06、0.13 mg·mL^-1时，SAPZFFW石油醚部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用均优于SAPZF石油醚部，且两者具有极显著性差异。（**p<0.01;*p<0.05）

3.3.2  SAPZFFW、SAPZF醇提物乙酸乙酯部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF与SAPZFFW乙酸乙酯部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见图4。在试验药物质量浓度0.03 ～0.50 mg·mL^-1范围内，SAPZFFW乙酸乙酯部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用均优于SAPZF乙酸乙酯部，且两者具有极显著性差异（**p<0.01;*p<0.05）。

3.3.3  SAPZFFW、SAPZF醇提物正丁醇部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF与SAPZFFW正丁醇部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见图5。在试验药物质量浓度0.03 ～0.25 mg·mL^-1范围内，SAPZFFW正丁醇部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用均优于SAPZF正丁醇部，且两者具有极显著性差异（**p<0.01;*p<0.05）。

3.3.4  SAPZFFW、SAPZF醇提物水部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用

SAPZF与SAPZFFW水部对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见图6。在低质量浓度时（<0.50 mg·mL^-1），SAPZFFW水部对乳腺癌细胞株MCF-7几乎无抑制作用，而当药物浓度达到1.00 mg·mL^-1时，SAPZFFW水部对肿瘤细胞的抑制率达到61.97%，与SAPZF水部相比，两者具有极显著性差异（**p<0.01;*p<0.05）。

4  结束语

全蝎含蝎毒蛋白、游离氨基酸、组织胺及胆甾醇、脂肪酸等水溶性和脂溶性成分^[7]。白术中含挥发油、黄酮类，倍半萜内酯化合物、多炔醇类化合物等，白术内酯为主要活性成分，对宫颈癌细胞株Hela，肺癌细胞株A549具有抑制生长作用^[8]。白头翁的主要成分有三萜皂苷、三萜酸、香豆素等成分。且三萜皂苷具有抗肿瘤作用^[9]。三者组成的方剂中，既有极性成分如蝎毒蛋白、氨基酸、三萜皂苷等水溶性成分，又有黄酮、白术内酯等脂溶性成分，所含成分复杂。球孢白僵菌作为一种生物催化剂，可与黄酮类、萜类化合物等发生羟基化反应，与有机酸、黄酮类、蒽醌类等化合物发生糖基化反应^[10]，也可以通过本身所产生的蛋白酶将发酵菌质中的蛋白类成分酶解、通过自身产生的聚酮合酶合成白僵菌素、环孢菌素等非核糖体肽。经研究表明：SAPZF抗肿瘤的有效部位为石油醚部、正丁醇部，且抗肿瘤能力由大到小依次为：石油醚部、正丁醇部;SAPZFFW抗肿瘤的有效部位为石油醚部、乙酸乙酯部以及正丁醇部，抗肿瘤能力由大到小依次为：正丁醇部、石油醚部、乙酸乙酯部。其中，正丁醇部在试验药物浓度0.03 ～0.5 mg/mL范围内均具有良好的抗肿瘤作用。同时，SAPZFFW在各极性部位对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用优于SAPZF，药用基质经发酵后，其成分的极性也发生了改变，提高了中、低极性的脂溶性物质的含量与药效。其原因一方面可能是药性培养基质中的蛋白类成分由大分子的蛋白酶解为小分子的多肽和寡肽从而增强了其药理活性，因为经过75%乙醇的提取，10 KDa相对分子量以上的大蛋白被沉淀过滤除掉，而10 KDa以下的小分子多肽和寡肽溶于75%乙醇而得以保留，正是这部分极性成分的增加，使得抗肿瘤活性得到加强。另一方面，可能球孢白僵菌在发酵的过程中产生了具有药理活性的水溶性的次生代谢物质或是其对药性培养基质中的物质进行了结构修饰与转化，从而增强了活性成分的抗肿瘤作用。有关生物转化机理有待于今后进一步的深入研究。

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