竹叶抗氧化物结合壳聚糖对青鱼片贮藏品质的影响

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

青鱼（black carp）又名黑鲩、螺蛳青，属鲤形目、鲤科的雅罗鱼亚科。主要分布于我国长江以南的平原地区，是长江中、下游和沿江湖泊里的重要渔业资源，2014年全国养殖产量约为55.7万吨，为我国淡水养殖的“四大家鱼”之一[1]。青鱼肉质鲜美肥腻，含有丰富的蛋白质、脂肪和矿物质，但宰杀后由于其营养丰富，极易发生腐败变质，因此寻求行之有效的保鲜技术具有重要的研究意义[2]。

近年来，由于天然生物保鲜剂具有安全、高效和方便等特点，已成为农产品、肉品、水产品等品质保鲜的研究热点[3]。竹叶抗氧化物（bamboo leaf antioxidants，AOB）是从竹叶中提取的抗氧化性成分，有效成分包括黄酮类、内酯类和酚酸类化合物，于2004年列入GB2760-1996《食品添加剂使用卫生标准》，允许其作为天然食品抗氧化剂在水产品中使用[4]。张晓丽等[5]研究表明竹叶抗氧化物对鲜罗非鱼片具有良好的抗菌和抗氧化作用。壳聚糖（chitosan）又称脱乙酰甲壳素，是甲壳素经化学处理脱乙酰基后的产物，是惟一的碱性天然多糖，在自然界中含量丰富，无毒安全，在各个领域都有广泛的应用[6]。因壳聚糖分子中带有游离氨基，在酸性溶液中易成盐，呈阳离子性质。能抑制一些真菌、细菌和病毒的生长繁殖。周强等[7]研究表明，壳聚糖复合膜组能有效保持鱼肉的感官品质，防止草鱼肉营养价值及鲜度的下降。陈军等[8]研究发现冰温结合壳聚糖涂膜处理能有效的提高草鱼片的保鲜效果，使草鱼片的货架期由9 d延长至15 d～18 d。

目前国内外将竹叶抗氧化物结合壳聚糖应用到青鱼保鲜的研究还未见报道。本文以竹叶抗氧化物和壳聚糖为复合保鲜剂，探究其对青鱼在4℃贮藏条件下的品质影响，为延长青鱼货架期提供理论支持和新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜青鱼：泰州市海陵区农贸市场；PE保鲜袋：泰州市大润发超市。

竹叶抗氧化物（总黄酮含量≥10%）（食品级）：河南豫中生物科技有限公司；壳聚糖（脱乙酰度≥90%）（食品级）：国药集团药业股份有限公司；氧化镁、硼酸、三氯乙酸、盐酸、氢氧化钠、甲基红、亚甲基蓝、1-丁醇、2-硫代巴比妥酸（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂培养基生化试剂：青岛高科海博生物科技有限公司；标准品腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosinix acid，IMP）、次黄嘌呤（inosine，Hx）、次黄嘌呤核苷（inosine，HxR）（纯度均＞99%）：美国 Sigma公司。其他常用试剂和药品均为国产分析纯。

1260 Infinity高效液相色谱仪、SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，粒径 5 μm）：美国 Agilent公司；T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KDN-04B半自动凯氏定氮仪：上海右一仪器有限公司；G154DW立式压力蒸汽灭菌锅：山东省诸城市食品机械有限公司；BGZ-240电热恒温干燥箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；HPX-9162MBE电热恒温培养箱：广州沪瑞明仪器有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多集团。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

鲜活青鱼去除鱼头、鱼尾、鱼鳞和内脏后，用无菌水洗净，自然沥干水分，取其脊背部鱼肉切成1 cm～2 cm厚的鱼片（约30 g），分别在特定浓度配比的保鲜剂溶液中浸渍5 min，取出沥干，用无菌食品自封袋分装并编号，置于4℃环境下贮藏。

1.2.2 复合保鲜剂最佳配比的确定

参考GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对食品中添加剂的使用量规定[9]（竹叶抗氧化物和壳聚糖在水产品中的最高许可用量分别为0.5 g/kg和6 g/kg），将一定量的竹叶抗氧化物、壳聚糖分别溶解于水和含有1%醋酸的水溶液中，配成不同浓度的单一生物保鲜剂[10]。由预试验的研究结果可知，竹叶抗氧化物溶液浓度为2 g/L，壳聚糖浓度为15 g/L保鲜效果较好。因此本试验采用竹叶抗氧化物、壳聚糖的取值水平分别为1 g/L～3 g/L和10 g/L～20 g/L，将不添加任何保鲜剂的0.5%醋酸溶液处理组作为空白对照组，试验设计如表1所示。

表1 试验设计表Table 1 Design for experimentation

按照表1的不同处理组处理青鱼片后，于4℃环境下贮藏5 d后进行挥发性盐基氮含量检测，确定最佳的复合保鲜剂配比。

1.2.3 复合保鲜剂对草鱼片贮藏品质的影响

选择最佳配比浓度的复合液处理鱼体作为试验组，不经复合液处理的鱼体作为空白对照组，对其在4℃贮藏温度下进行综合感官评定，并测定其挥发性盐基氮含量（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid，TBA值）、K值和菌落总数的变化，每隔2 d测定鱼体1次。

1.2.4 鲜度指标检测方法

1.2.4.1 综合感官评定

依据GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》[11]，感官评定由受专门培训的感官评定小组6人（3男3女），对各处理组青鱼片的色泽、气味、状态等进行综合评分，最后取其综合评分值[12]，具体评分标准见表2。色泽、气味、状态权重分别为0.3、0.4、0.3，计算加权平均分。最高分为5分，最低分为1分，3分以下评定为不合格，已不新鲜，不再适合食用。

表2 青鱼片感官评分标准表Table 2 The sensory evaluation standard table of black carp fillet

续表2 青鱼片感官评分标准表Continue table 2 The sensory evaluation standard table of black carp fillet

1.2.4.2 挥发性盐基氮含量测定

参照GB5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮仪法[12]。

1.2.4.3 硫代巴比妥酸值（TBA）测定

参照GB/T35252-2017《动植物油脂2-硫代巴比妥酸值的测定直接法》[13]。

称取2 g（m）鱼肉糜，转移至25 mL容量瓶中，用1-丁醇溶解并稀释至刻度，吸取5 mL样品液加入具塞试管中，加入5 mLTBA试剂，充分混匀。将具塞试管置于95℃水浴锅中加热2 h，冷却至室温（25℃）。将具塞试管中的溶液转移到干净、干燥的10 mm比色皿中，用蒸馏水在530 nm处校正分光光度计零点，测定溶液吸光度（A）同时做试剂空白，测定试剂空白吸光度（B）。TBA值按以下公式计算。

式中：A为被测溶液的吸光度；B为空白试剂的吸光度；m为样品的质量，mg；50为试样用1-丁醇稀释至25 mL并用10 mm比色皿测定吸光度的有效因子。

1.2.4.4 K值的测定

参照SC/T 3048-2014《鱼类鲜度指标K值的测定高效液相色谱法》[14]。称取均质后的鱼肉样品（2.00±0.02）g放入离心管内，加入10%的高氯酸溶液20 mL，涡旋振荡1 min，在4℃下8 000 r/min离心10 min，取出上清液，再用5%高氯酸溶液10 mL提取沉淀物中的待测物，在4℃下8 000 r/min离心10 min。重复操作1次，合并上清液。用10 mol/L的NaOH溶液调提取液pH值近6.0，然后再用1 mol/L的NaOH溶液继续调节pH值至6.0～6.4。将已调好pH值后的溶液移至经预冷的容量瓶中，用4℃蒸馏水定容至50 mL。在4℃下8 000 r/min离心10 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液于4℃下保存，待测。

K值计算公式：

式中：MHxR为次黄嘌呤核苷含量，μmol/g；MHx为次黄嘌呤含量，μmol/g；MATP为三磷酸腺苷含量，μmol/g；MADP为二磷酸腺苷含量，μmol/g；MAMP为腺苷酸含量，μmol/g；MIMP为肌苷酸含量，μmol/g。

1.2.4.5 菌落总数测定

参照GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中的平板计数法进行测定[15]。

称取25 g碎青鱼肉置盛有225 mL生理盐水的无菌均质杯内，8 000 r/min～10 000 r/min均质 1 min～2 min，制成料液比为1∶10（g/mL）的样品匀液。并依次进行10倍递增稀释处理，最终在1∶100和1∶1000稀释液中取1 mL涂布在培养基表面，（30±1）℃培养（72±3）h，每个稀释梯度最少做2个平行。

2 结果与分析

2.1 复合保鲜剂最佳配比的确定

青鱼片经茶多酚和壳聚糖复合液处理后，在4℃环境下贮藏5 d后的TVB-N含量，如图1所示。

图1 青鱼片经不同比例复合保鲜剂处理5 d后的TVB-N值Fig.1 TVB-N Value of black carp fillet treated with different proportions of compound preservative for 5 days

由图1可知，青鱼片分别经9组A2至A10不同比例复合保鲜剂处理后，TVB-N值均显著低于空白对照组A1组，其中，A9组TVB-N值最低，说明3g/L竹叶抗氧化物与15 g/L壳聚糖组成的复合保鲜剂保鲜效果最好，因此，选择3 g/L竹叶抗氧化物与15 g/L壳聚糖作为最佳复合保鲜剂进行后续对青鱼片贮藏品质的研究。

2.2 复合保鲜剂处理对青鱼片贮藏品质的影响

2.2.1 复合保鲜剂对青鱼片在贮藏中感官品质的影响

鱼肉中脂肪氧化酸败产生丙二醛等物质，蛋白质在酶及微生物作用分解产生氨、三甲胺、硫化氢等物质，这些物质均会使鱼体产生腐败性的刺鼻气味。微生物代谢产物及脂肪氧化导致的色素分解会使鱼肉色泽发生变化；由于蛋白质的分解使得鱼肉组织结构受到破坏致使鱼肉组织松散、无弹性，组织状态发生变化[16]。青鱼贮藏期间感官评分的变化如图2所示。

图2 青鱼片贮藏过程中感官评分的变化Fig.2 Changes of sensory score in the storage of black carp fillets

由图2可知，贮藏期间复合保鲜剂组和空白对照组的感官评分值均随着时间的延长而下降。空白对照组感官评分值下降趋势较复合保鲜剂组显著，在第8天时感官评分值仅为3.08±0.01，而复合保鲜剂组感官评分值在整个贮藏期间下降缓慢，感官评分值均高于空白对照组，在第14天时仍大于3，说明复合保鲜剂能显著抑制鱼肉感官品质下降，使其在较长时间内维持良好的贮藏品质。

2.2.2 复合保鲜剂对青鱼片在贮藏中TVB-N含量的影响

挥发性盐基氮（TVB-N）是指动物性食品中蛋白质由于肌肉内源酶或微生物的作用，分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮挥发性物质[17]。TVB-N值通常作为水产品腐败变质的评定指标。GB2733-2015规定，淡水鱼虾的TVB-N值≤20 mg/100 g[11]。青鱼在4℃贮藏过程中的TVB-N含量变化如图3所示。

图3 青鱼片贮藏过程中TVB-N值的变化Fig.3 Changes of TVB-N value in the storage of black carp fillets

由图3可知，在4℃贮藏条件下，复合保鲜剂组和空白对照组的TVB-N含量在贮藏初期（0～4 d）差异不显著。随着贮藏时间的增加，空白对照组的TVB-N含量急剧上升，而复合保鲜剂组的TVB-N含量上升较缓慢，两组差异逐渐增大。空白对照组在贮藏8 d时的TVB-N含量已达（20.32±0.02）mg/g，超过了国标规定的20 mg/100 g的上限值。复合保鲜剂组样品贮藏8d时的 TVB-N 含量为（8.52±0.01）mg/g，8 d后 TVBN值上升较之前稍快，到第14天时，TVB-N含量为（30.38±0.02）mg/g，达到上限值。说明竹叶抗氧化物-壳聚糖复合保鲜剂的添加减缓了TVB-N的生成，可使青鱼在4℃贮藏温度下的货架期由6 d～8 d延长至12 d～14 d。

2.2.3 复合保鲜剂对青鱼片在贮藏中TBA值的影响

TBA是反映脂肪氧化程度的重要指标，广泛应用于测定肉类、水产品等产品的脂肪氧化酸败程度。TBA值越大，说明脂肪氧化腐败程度越高，鱼肉的腐败程度越高，鱼肉的品质越低。青鱼在贮藏期间TBA值变化如图4所示。

图4 青鱼片贮藏过程中TBA值的变化Fig.4 Changes of TBA value in the storage of black carp fillets

由图4可知，随着时间的延长复合保鲜剂组和空白对照组的TBA值均逐渐增大，呈不断上升趋势。复合保鲜剂组在整个贮藏期间的TBA值均显著低于空白对照组，在贮藏第10天时，空白对照组的TBA值达到了0.138±0.004，而复合保鲜剂组的TBA值变化幅度不大，从初始的0.018±0.001才上升至0.082±0.002。表明竹叶抗氧化物和壳聚糖复合保鲜液能明显抑制不饱和脂肪酸的氧化分解，减少丙二醛的生成，从而延缓青鱼片的货架期。

2.2.4 复合保鲜剂对青鱼片在贮藏中K值的影响

K值是评价水产品质量的一个重要鲜度指标，反映了水产品初期三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）的降解程度。一般来讲，鲜杀鱼的K值通常低于10%，K值在20%以下为一级鲜度，可作为生食鱼肉，K值在20%～40%为二级鲜度，K值在60%～80%为初期腐败。青鱼在贮藏期间K值变化如图5所示。

图5 青鱼片贮藏过程中K值的变化Fig.5 Changes of K value in the storage of black carp fillets

由图5可知，空白对照组K值增长速率较快，贮藏至6 d时为（45.87±0.01）%，超过了二级鲜度，贮藏至8 d时为（60.32±0.02）%，已开始腐败变质。复合保鲜剂组贮藏10 d时K值为（35.88±0.01）%，仍在二级鲜度范围，贮藏14 d时为（59.32±0.02）%，接近腐败变质的上限，说明竹叶抗氧化物和壳聚糖复合保鲜液能有效抑制微生物的生长繁殖，抑制鱼肉中的核苷酸酶的活性，从而减少AMP的降解，表现出较好的贮藏效果。

2.2.5 复合保鲜剂对青鱼片在贮藏中菌落总数的影响

鱼肉的腐败与细菌的生长繁殖密切相关，鱼肉中菌落总数是反映鱼类腐败程度的重要指标。图6为青鱼在贮藏过程中的菌落总数变化[18-19]。

图6 青鱼片贮藏过程中菌落总数的变化Fig.6 Changes of colony count in the storage of black carp fillets

由图6可知，空白对照组与复合保鲜剂组鱼肉样品的菌落总数均随着贮藏时间的延长而逐渐增加。在整个10 d的贮藏期内，空白对照组菌落总数均高于复合保鲜剂组。空白对照组在贮藏第8天时，菌落总数对数已达（6.25±0.01）CFU/g，超过了规定的可食用限量标准6 CFU/g；而复合保鲜剂组青鱼的菌落总数增长速率明显减慢，贮藏至第14天时菌落总数对数为（6.08±0.01）CFU/g，刚超过限量标准值。由此可知，4℃贮藏条件下，复合保鲜剂组处理组可使青鱼片货架期由6 d～8 d延长至12 d～14 d。竹叶抗氧化物和壳聚糖复合保鲜剂杀菌机理可能是其具有协同抑菌作用，可使细菌细胞膜蛋白质发生变性而起到了杀菌作用[20-21]。

3 结论

本文以青鱼片为研究对象，探究了在4℃低温贮藏条件下，竹叶抗氧化物与壳聚糖复合保鲜剂对青鱼片贮藏品质的影响。结果表明：竹叶抗氧化物与壳聚糖复合保鲜剂具有较好的保鲜效果，3 g/L竹叶抗氧化物与15 g/L壳聚糖为最佳配比。在经最佳复合保鲜剂处理后，其菌落总数、TVB-N、TBA、K值均明显低于未经保鲜剂处理的对照组，而感官评分高于对照组，货架期可由6 d～8 d延长至12 d～14 d。本研究对青鱼品质控制、保鲜加工具有一定的参考价值。