红松根腐病病原的鉴定与检测1)

张平 刁健 王立海

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

红松(Pinuskoraiensis)是著名的经济树种之一，木材具有纹理直、材质轻等特点，2013年被列入《世界自然保护联盟》(IUCN)濒危物种红色名录ver3.1-低危[1]。除此之外，红松还具有重要的生态价值，属于所在森林系统中的顶级群落，为重要的支撑树种[2-3]。由于生态恶化和温暖潮湿的环境导致红松病害频繁发生，例如由奥氏蜜环菌(Armillariasolidipes)引起红松干基腐朽病[4]。通过林业技术措施、改善不良生长环境，以及适时使用杀菌剂等方法可以控制大部分病害[5]。但是，如果对于新的病害无法正确鉴定病原菌则很难找到合适的防控方法[6]。2018年，在中国黑龙江省伊春市和黑河市红松苗圃地相继发生1种病害，该病害发病速度快，数天内可造成大量的红松幼苗死亡，目前还没有较好的防治方法来阻止其传播。基于最初的判断，蜜环菌被认定为是致病菌。但通过形态学观察，该病原菌显示大分生孢子和瓶梗状产孢结构与尖孢镰刀菌集合群(FOSC)特征相似[7-8]。对病害的管理和防治需要对致病菌进行可靠地鉴定与检测。分子生物学技术，特别是聚合酶链式反应(PCR)技术，为多种植物病原菌和许多土传性病害的诊断和检测提供了一个灵敏的方法[9]。一些基因区域，如内部转录间隔区(ITS)和翻译延长因子(TEF1-α)都可以用于识别和区分镰刀属真菌[10]。FOSC中的各个成员在世界广泛分布，已知报道的有500多种，常造成园艺作物重大经济损失[11]。实际上，FOSC中的一些成员可以同时侵染多种植物，如茄镰孢菌(Fusariumsolani)可以引起番茄(Lycopersiconesculentum)、西瓜(Citrulluslanatus)、大豆(Glycinemax)病害。有些镰刀菌属真菌产生的毒素，严重威胁人畜健康[12-13]。因此，本研究的目的是分离、鉴定和测定分离物对红松盆栽苗的致病力，通过PCR技术区分红松上的致病菌与其他真菌，并寻找病原菌的传播来源。

1 材料与方法

材料：马铃薯琼脂培养基(PDA)参考Fall et al.[12]的制作方法，将200 g马铃薯洗净去皮后切成小块，加入蒸馏水1 000 mL，加热煮沸，过滤，加入15 g琼脂粉和20 g葡萄糖，溶解后分装至500 mL容量瓶。主要试剂有真菌DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek公司D3690)、胶回收试剂盒(北京天根公司DP204)。

病样采集及症状观察：红松病样组织从伊春和黑河市的露天苗圃地采集，采集后立即装入塑料袋，并在冰盒中保存。共收集17个样本(伊春12个，黑河5个)。采集的红松病样具有典型发病症状，表面可见明显的病斑，观察并记录病害症状，包括发病部位、病斑颜色、大小。

病原菌的分离培养及形态观察：采用组织分离法[14]，用无菌解剖刀从病健交界处切取5～10 mm的病斑，用体积分数0.05% NaClO表面消毒1 min，体积分数70%酒精消毒3 min，最后用无菌蒸馏水清洗3次。无菌吸水纸进行干燥后收集病组织，一部分储存在冰箱中(-20 ℃)用于DNA的提取，一部分用于病原菌的分离。对照试验来源于未发病的健康组织，处理方式与病斑处理方式相同。参考刘瑞玲等[15]方法，将消毒后的红松病组织放置在PDA平板中，平板置于26 ℃、黑暗培养5 d。挑取边缘菌丝，通过传代培养方式进行菌株纯化，直到形成单一的菌落。最后，观察并记录PDA培养基上的菌落形态特征，分别在普通光学显微镜和扫描电镜下观察菌丝、分生孢子、分生孢子梗等。

致病性测定：将所有分离物进行致病性测定，红松种子表面用体积分数0.05% NaClO消毒20 min，在经过高压湿热灭菌(121 ℃，2 h)的土壤里播种，出苗后每盆保留1株苗。红松在温室25 ℃、70%的相对湿度和光周期(14L∶10D)的条件下培养5个月。每15 d浇1次水。随后进行致病性测定，将从红松病组织中分离得到的菌株，接种到PD培养液中，28 ℃恒温震荡培养8 d，以达到最大产孢量。使用无菌水将孢子稀释为2.5×108菌落·mL-1(OD600)，将孢子悬浮液注射到土壤中，每盆5 mL。以注射5 mL无菌水为空白对照。将红松苗转移至生长室，在25 ℃、80%的相对湿度和光周期(16L∶8D)的条件下生长，每天观察并记录发病情况。对真菌菌落和苗木根周腐烂坏死组织进行PCR分析，以确定病原菌的一致性。每处理3次重复，每重复20株苗。

病原真菌分子生物学鉴定：用无菌刀片刮取在PDA培养5 d的真菌菌丝，用于DNA提取。所有植物组织和菌丝用液氮充分研磨后使用真菌DNA提取试剂盒提取。DNA质量浓度用紫外分光光度计测量(Thermofisher A30221美国)，用无菌水将DNA稀释最终质量浓度为50 mg·L-1，用于进一步的PCR反应。ITS基因引物为ITS1F，5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS4R，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR扩增参数为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃再延伸5 min。TEF-α基因引物为TEF1αF，5′ATGGGTAAGCARGACAAGAC-3′；TEF1αR，5′-GGARGTACCAGTSATCATCGCT-3′。PCR扩增参数为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃再延伸1 min。扩增后产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工生物工程技术有限公司测序，测序序列在GenBank中进行Blast比对，利用MEGA7.0软件构建系统发育树[16-17]。

2 结果与分析

2.1 危害及症状

通过在伊春和黑河市的红松苗圃地调查发现，红松发病初期地下部分根部(图1A)和种子(图1B)表皮最先皱缩、出水、腐烂，表面可见白色菌丝体，芽不能正常出土，最终枯死。地上部分叶尖初期黄化，随后逐渐褐变、干枯(图1C)，叶片不脱落，不能正常展叶，潮湿天气下，叶尖部位产生白色菌丝体(图1D)，逐渐下移，最终导致植物枯萎死亡(图1E)。若不加以防治，从首次观察到病斑至15 d，红松植株会死亡。

2.2 分离物培养性状与形态特征

从具有红松根腐病典型症状的样本中分离得到15株分离物，根据形态学特征将这些分离物分为一类，选择具有代表性的1株菌用于后续试验，命名为TZ3。菌株TZ3在PDA培养基上初期为白色棉絮状菌落，后期变成浅红色，背面有紫红色色素产生(图2A和2B)。气生菌丝上产孢，孢子着生于长筒形单瓶梗(图2C)。厚垣孢子球形，单生，直径6.5～12.5 μm(图2D)。大型分生孢子镰刀形，月牙形，稍弯或弯曲，两端逐渐变尖，有隔膜，大小为(19.1～45.1)μm ×(2.5～6.4)μm(图 2E)。

2.3 致病性

将菌株TZ3接种到健康植株后，对照植物正常展叶，根部浅褐色(图3A)，而处理组植株发病症状与原发病植株相同。地下部芽和根部发生腐烂，布满白色菌丝(图3B和3C)。第2～3天所有接菌植株的根部均出现腐烂。7 d后，出现萎蔫，由根部向地上茎部扩展，表面可见少量的白色菌丝体(图3D、E)。地上部叶片萎蔫，不能正常展叶(图3F)，叶尖褪绿，但未见菌丝体(图3G)。从腐烂组织周围取样分离出的真菌，接种后植株再次发病症状与本次发病症状相同，符合柯赫氏法则。

2.4 分子生物学鉴定

使用真菌引物ITS1F/ITS4R对菌株TZ3 DNA扩增后可以得到525 bp大小的产物(图4A)，进行克隆和测序后，得到的DNA序列提交到NCBI获得登录号MK791651，与GenBank进行比对后，第1组中525 bp的条带序列与尖孢镰刀菌(登录号KT803066.1，DQ984712.1)在同一分之，支持率为99%(图5A)。为了进一步验证ITS测序结果的可靠性，利用真菌引物TEF1αF/TEF1αR进行第2次PCR扩增。菌株TZ3得到1条972 bp大小的条带(登录号MK818444)(图4B)。第2组中972 bp的(图4B)条带序列与尖孢镰刀菌(登录号EU246584.1)在同一分支，支持率为98%(图5B)。第2组的测序结果与真菌通用引物ITS1F/ITS4R的鉴定结果一致。综合以上测序结果将菌株TZ3鉴定为尖孢镰刀菌。

3 讨论

镰刀菌属真菌能够引起多种寄主产生病害，准确识别病原对于病害的防治至关重要。传统的形态特征观察不能准确区分FOSC中具体的种类[18-19]，并且该属真菌的培养特性易受环境等因素影响[20]。在这种情况下，通过分子手段检测和区分病原菌具有重要意义[21-23]。本研究最初通过通用引物ITS基因将分离物鉴定为镰刀菌属真菌，而无法鉴定到具体的种水平。后续通过设计TEF基因引物，2轮扩增比对后得出引起红松根腐病的病原菌与尖孢镰刀菌在同一系统进化分支。国内外许多研究报道中，通过设计基因位点引物，例如TEF、IGS、EF1等，用于镰刀菌属真菌种水平的鉴定[24-26]。除此之外，可通过PCR技术对混合样品中的目标菌和类似真菌进行区分，用于寻找病害的传播来源[27-29]。本研究中，在伊春市和黑河市发病红松苗圃地土壤中能够检测到尖孢镰刀菌的存在，这表明菌源来自苗圃地的土壤。

目前，国内已知报道的红松病害有5种，分别为红松烂皮病(Cenangiumferruginosurn)、根朽病(Armillariellamellea)、流脂溃疡病(Tympanisconfusa和Leucostomakunnc)和疱锈病(Cronartiumribicola)[30]。但对红松根腐病的研究较少，还没有关于尖孢镰刀菌引起红松根腐病的相关报道。本研究从伊春市和黑河市的病害样本中分离出真菌TZ3，经过形态学特征和分子生物学技术将该菌鉴定为尖孢镰刀菌，致病性试验中发现该菌可以导致红松盆栽苗枯萎、死亡。经过柯赫氏法则验证，证实尖孢镰刀菌是导致苗圃地红松根部腐烂、枯萎和死亡的致病菌。此外，PCR技术是用于快速检测红松根腐病病原菌的一种有利的工具，在播种前对苗圃地土壤进行检测是防止该病害扩散最合理有效的方法。本研究结果可为红松根腐病的防治、抗病育种提供参考。