超高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中35种性激素

胡 贝，李丽霞，刘 红，杨飘飘，李晓健，黄 伟，丁晓萍

(1.湖北省药品监督检验研究院，湖北 武汉 430075；2.湖北省药品质量检测与控制工程技术研究中心，湖北 武汉 430075)

性激素是一种类固醇激素，包括雄激素、孕激素和雌激素[1]，其主体结构为环戊烷并多氢菲核，不同化合物间的差别是环上碳原子所连的基团不同[2-3]。它不仅具有控制性器官和第二性征的作用[4-5]，还参与人体内脂肪、蛋白质、糖分、无机盐等生命基本物质的代谢活动[4]，是影响生殖健康的重要因素[6]。当添加性激素的化妆品直接作用于皮肤上，短期内可见促进乳腺发育、增加毛发生长等作用，但长久使用会造成色素沉积、发育异常及人体代谢紊乱等副作用，甚至有致癌性[4,7]。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)[8]和欧盟化妆品法规(Council Directive 76/768/EEC)[9]均将性激素列为禁用组分。

目前化妆品中性激素的分析方法有液相色谱法[10-11]、气相色谱-质谱法[8]、液相色谱-质谱法[12-18]、聚合物整体柱微萃取-高效液相色谱法[19]、固相萃取-微乳液相色谱法[20]、凝胶渗透色谱-液相色谱-串联质谱法[21]、超高效合相色谱法[22]等。其中，超高效液相色谱-串联质谱法因具有分析时间短、灵敏度高、特异性好等优点，已成为近年来化妆品中禁用组分分析的首选方法。《化妆品安全技术规范》(2015年版)中 ，采用高效液相色谱法及气相色谱-质谱法测定雌三醇等7种组分，其中高效液相色谱法虽前处理步骤简便，但无质谱确证，可能造成假阳性，而气相色谱-质谱法需衍生化，操作繁琐、耗时；新增标准采用液相色谱-串联质谱法检测化妆品中的63种激素类成分，其中仅包括13种性激素。林志惠等[12]、李晶瑞等[13]、郑利等[17]利用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱分别建立了同时测定化妆品中21种、15种和3种性激素的方法，陈少波等[14]运用QuEChERS-高效液相色谱-质谱联用建立了快速筛查化妆品中112种禁用药物(含4种性激素)的方法，岳磊等[15]、茹歌等[16]运用超高效液相色谱-质谱联用分别建立了同时测定化妆品中5种和13种性激素的方法，刘齐等[18]运用高效液相色谱-质谱联用建立了同时测定育发液中9种禁限用物质(含7种性激素)的方法。而我国实际生产并使用的性激素高达几十种[4]，故现行标准方法及文献报道方法可同时检测的性激素种类仍较少，可能存在不法商家为规避执法添加法定检测组分以外的性激素的违法行为。综上所述，建立一种前处理方法简便省时、适应性良好、涵盖性激素种类多、定性定量准确的检测方法成为亟待解决的问题。

本文以液体水基类、乳液类、膏霜类化妆品为研究对象，通过对提取溶剂、提取方式和提取时间等参数的优化，建立了可快速同时测定化妆品中35种性激素的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法。本方法可分析的性激素种类多于现有国家标准及文献报道，且前处理步骤简便、灵敏度高、准确性好，能满足高效率日常监督抽检的需要，可为化妆品中性激素检测方法的国家标准制修订提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQ-S质谱仪(美国Waters公司)；ST16台式离心机(德国Thermo Fisher Scientific公司)；LC-250型超声波清洗器(山东济宁鲁超超声设备有限公司)。

群勃龙(纯度96.3%，下同)、勃地酮(98.8%)、诺龙(96.7%)、氧甲氢龙(99.0%)、睾酮(99.2%)、21-羟基孕酮(99.8%)、甲睾酮(97.7%)、雄烯二酮(99.3%)、17-α-羟基孕酮(99.5%)、氯司替勃(99.5%)、甲羟孕酮(99.0%)、孕酮(99.7%)、醋酸美伦孕酮(97.7%)、醋酸甲羟孕酮(99.0%)、醋酸氯睾酮(97.0%)、丙酸睾酮(99.7%)、双酚A(99.8%)、17-β-雌二醇(95.4%)、17-α-雌二醇(99.3%)、雌酮(99.6%)、己烯雌酚(97.4%)、双烯雌酚(96.6%)、己烷雌酚(99.14%)均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司；炔诺酮(99.4%)、孕三烯酮(99.7%)、孕二烯酮(99.4%)、达那唑(99.2%)、醋酸氯地孕酮(100%)、己酸羟孕酮(99.8%)、苯丙酸诺龙(99.1%)、雌三醇(97.6%)均购于中国食品药品检定研究院；肾上腺甾酮(98%)、美雄酮(95%)均购于Toronto Research Chemicals公司；表睾酮(1 mg/mL)购于Cerilliant公司；炔诺孕酮(100%)购于European Pharmacopoeia公司；甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；实验用水为一级水(由美国密理博公司Milli-Q超纯水机制备)。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)；流动相：A为乙腈，B为水；流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样体积为2 μL。梯度洗脱程序：0～13 min，5%～35% A；13～14 min，35% A；14～15 min，35%～48% A；15～17 min，48% A；17～24 min，48%～85% A ；24～26 min，85% A；26～27 min，85%～5% A；27～31 min，5% A。

1.2.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI+和ESI-)；扫描模式：多反应监测(MRM)；正离子喷雾电压：3.2 kV；负离子喷雾电压：2.8 kV；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流速：800 L/h；进样锥气体流速：150 L/h。35种性激素的质谱参数见表1。

表1 35种性激素的质谱参数Table 1 MS parameters of 35 sex hormones

1.3 样品前处理

称取均匀试样0.2 g(精确至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，加入2 mL乙腈，在涡旋仪上分散(水状样品涡旋1 min，乳状样品和霜状样品均涡旋2 min)，然后加入50%乙腈水溶液至近刻度，超声提取20 min后取出。待样品恢复至室温后，用50%乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，8 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，上机测定。

1.4 系列基质标准曲线溶液的配制

标准储备溶液：准确称取各标准品约10 mg(精确至0.01 mg)分别置于不同的10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，摇匀即得质量浓度约为1 mg/mL的各性激素标准储备溶液。

混合标准溶液：精密量取适量各性激素标准储备溶液置于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀即得质量浓度约为1 mg/L的混合标准溶液。

分别取水状、乳状、霜状基质空白样品各7份于10 mL容量瓶中，每份0.2 g(精确至0.000 1 g)，分别加入混合标准溶液适量，按“1.3”步骤进行前处理，即得质量浓度分别约为2、4、10、20、30、40、50 μg/L的系列基质标准曲线溶液。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择根据文献报道[10-17]，本实验考察了甲醇、乙腈、90%甲醇水溶液、50%甲醇乙腈和50%乙腈水溶液5种提取溶剂的效果。称取15份均匀的空白水状样品(每份约0.2 g)，分为5组(每组平行3份)，分别加入适量的混合标准溶液，使样品中各性激素的加标量均为1.00 μg/g，分别采用上述提取溶剂进行提取，其他操作按“1.3”进行前处理，计算样品的加标回收率。结果表明，采用甲醇、乙腈、90%甲醇水溶液、50%甲醇乙腈和50%乙腈水溶液作为提取溶剂时，35种性激素的加标回收率分别为73.7%～114%、68.4%～113%、73.5%～118%、77.4%～118%和81.4%～118%，相对标准偏差(RSD)分别为0.40%～8.1%、0.50%～8.7%、0.90%～10%、0.50%～10%和1.1%～9.5%。由于50%乙腈水溶液作为提取剂时35种性激素的回收率最好且RSD满足分析要求，因此选择提取溶剂为50%乙腈水溶液。

2.1.2 提取方式及提取时间的选择分别考察了超声、涡旋和振荡3种方式的提取效果。称取9份均匀的空白水状样品(每份约0.2 g)，分为3组(每组平行3份)，分别加入适量的混合标准溶液，使样品中各性激素的加标量均为1.00 μg/g，分别采用上述提取方式进行提取，其他操作按“1.3”进行前处理，计算样品的加标回收率。结果表明，采用超声、涡旋和振荡方式进行提取时，35种性激素的加标回收率分别为87.0%～115%、84.3%～116%和80.9%～116%，RSD分别为2.7%～8.7%、1.3%～8.0%和0.60%～10%。超声提取的回收率总体较好，且简便易操作，因此进一步同法考察了超声提取时间分别为10、20、30 min时35种性激素的回收率。结果显示，超声时间为10、20、30 min时，35种性激素的加标回收率分别为76.4%～114%、89.7%～111%和84.6%～112%，RSD分别为0.50%～8.3%、0.10%～13%和0.20%～13%。超声提取时间为20 min时的回收率最高。综上，实验选择超声提取20 min。

2.2 色谱条件的优化

考察了CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)3种色谱柱的分离效果。结果表明，在同等色谱条件下，35种性激素在CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)柱上的峰形对称、尖锐，各母离子、子离子相同或相近的组分(表1中组分1和5、3和13、7和15、9和14、18和25、30和31、32和35)均能实现良好分离，可以准确定性、定量。因此，选择CORTECS C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)柱进行分离。

2.3 质谱条件的优化

采用直接灌注的进样方式，在正、负离子扫描模式下，对各性激素进行全扫描，得到其母离子后，采用二级质谱扫描确定各性激素的子离子，并进一步优化其锥孔电压(CV)和碰撞能量(CE)。优化的质谱条件见“1.2.2”，此条件下35种性激素的稳定性好，灵敏度高，其MRM图见图1。

2.4 线性范围与检出限

根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)[8]及文献报道[16]，选择配制系列基质标准曲线溶液以消除基质效应的干扰。在优化条件下，以定量离子对的峰面积为纵坐标(y)，对应质量浓度为横坐标(x,μg/L)绘制基质标准曲线，并以3倍信噪比计算方法检出限(LOD)，10倍信噪比计算方法定量下限(LOQ)。结果表明，35种性激素在一定的质量浓度范围内线性良好，相关系数(r)均大于0.99，LOD为0.028～0.117 μg/g，LOQ为0.093～0.352 μg/g(见表2)。

图1 35种性激素的UPLC-MS/MS MRM谱图Fig.1 UPLC-MS/MS MRM chromatograms of 35 sex hormonesthe numbers denoted(1-35) were the same as those in Table 1

2.5 加标回收率与相对标准偏差

称取水状、乳状、霜状3种基质均匀空白样品各18份(每份约0.2 g)于10 mL容量瓶中，分为3组(每组平行6份)，分别添加适量混合标准溶液，使3组样品中各组分的加标量分别为0.25、0.50、1.00 μg/g，按“1.3”处理样品并进行加标回收实验。结果表明，水状、乳状基质样品的加标回收率分别为84.5%～112%和84.0%～116%，RSD分别为1.7%～11%和1.5%～12%；霜状基质样品的加标回收率为84.0%～117%，RSD为2.1%～14%(见表2)。该方法回收率和重现性良好，准确性高，适应性好，可作为化妆品中35种性激素的检测方法。

表2 35种性激素的线性范围、检出限、定量下限及霜状样品的加标回收率、相对标准偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,LODs,LOQs of 35 sex hormones and spiked recoveries,RSDs(n=6) of cream sample

2.6 实际样品的测定

为评价方法的适用性，采用该方法对日常监督抽检中的15批化妆品(含水状、乳状、霜状化妆品各5批)进行了测定，结果均为未检出，样品中的杂质峰对目标峰均无干扰，可准确定性、定量。使用本方法进行测定，前处理时间约1 h，上机分析时间为31 min，相较于其他分析方法更适合化妆品中多种性激素的快速筛查。

3 结 论

本文建立的同时测定化妆品中35种性激素的超高效液相色谱-串联质谱法，相较于《化妆品安全技术规范》(2015年版)及文献报道中性激素的检测方法，增加了性激素的检测种类，且前处理简便快捷、分析时间短、适应性强，适应于现今高效日常监管的理念，可为化妆品中35种性激素的大批量日常监督抽检和国家标准的制修订提供科学依据。