药用植物种质资源的超低温保存△

李翠，陈东亮，陈晓英，雷明，郭晓云，缪剑华

广西壮族自治区药用植物园/广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023

长久以来中药用传统方式为世人健康服务，其需求量正随着人们对健康生活需求的提升而不断增长。全世界75%以上的人口以植物作为治疗、预防疾病的药物来源。全国中药资源普查资料显示，我国目前处于濒危状态的植物有近3000种，其中药用植物占60%～70%，特别是珍稀濒危野生药用植物资源量急剧下降，如红景天、金线莲和冬虫夏草等，更是面临着灭绝的危险。因此，药用植物资源的保护同其他重要资源的保护一样，具有非常重要的战略意义。

药用植物保存方式主要有原位保存和离位保存。离位保存主要为种子保存和离体保存。超低温保存是20世纪60年代新兴的一门技术，其为种质资源离体保存开辟了一条新路径。药用植物超低温保存是指将药用植物的茎尖、种子或花粉等组织或器官在超低温冰箱(-80 ℃)、液氮蒸汽相(-150～-180 ℃)或液氮(-196 ℃)中冷冻保存并成功复苏的方式[1]，目前最主要的冷源为液氮。

1 药用植物超低温保存原理及优势

超低温保存原理主要有细胞冻害理论和溶液玻璃化理论2种。从本质上讲，药用植物超低温保存主要是药用植物细胞、组织、器官等在超低温冷冻过程中，细胞的生长和酶的代谢活动接近停止，处于 “假死 ” 状态，当其恢复到合适条件时又能进行正常的生长发育。在这一系列过程中，药用植物细胞仅发生了可逆的物理结构变化，化学组成并没有发生实质性改变，避免了材料在保存过程中可能造成的细胞活性损伤及遗传性状的退化和变异，因此其在解冻后仍然能保持正常细胞的生长、代谢活性、形态发生潜能及遗传稳定性[2]。

相对活体保存、种子保存等其他种质资源保存方法，药用植物超低温保存不受季节、土壤、气候等自然环境条件影响，能使保存的材料免受病、虫、毒的侵害，便于国际和地区间的种质交换，随时快速繁殖大量健康植株，保存过程可以减少大量人力、物力和财力，更重要的是使种质资源得以长期保存且不需考虑基因丢失、遗传变异等问题。超低温保存已成为目前公认的最为安全、经济、有效的药用植物种质资源保存方法，尤其是针对中间性种子药用植物、顽拗性种子药用植物及无性繁殖药用植物材料。

2 药用植物超低温保存技术

2.1 材料的选择

材料大小、抗冻性及细胞的生理状态和年龄等因素对超低温保存效果有较大的影响，其中植物细胞的生长年龄是决定复苏率的最重要因素[3]，因此，应根据植物种类，选择适宜进行超低温保存的材料类型并适时取材。药用植物超低温保存材料主要有幼嫩组织、组织培养物和植物器官三大类。从目前的研究来看，大多数植物材料在成熟期的冷冻保存效果较好。种子在形态后熟和生理后熟过程中自由水含量大大降低，是目前超低温保存应用最多的药用植物材料，而体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁的小分生细胞的存活率高于含大量液泡的大细胞。

药用植物的一些幼嫩组织(如茎尖分生组织和芽)因细胞分化程度低、在保存后的再生过程中遗传稳定性好，是超低温保存的理想材料[2]。目前，已成功实现高山红景天、百合等药用植物茎尖的超低温保存，液氮冷冻保存后莪术茎尖的成活率达到90%以上[4]。愈伤组织本身极易发生染色体的自发畸变而变异且胚状体一般是由愈伤组织分化而来，因此，药用植物愈伤组织和胚状体是最常见的超低温保存组织培养物。目前，已成功实现人参等植物的愈伤组织和浙贝母等植物的胚状体的超低温保存，且保存后成活率均在60%以上[25]。花粉和种子是药用植物超低温保存的2类器官材料。由于花粉和一些种子的生长寿命时间较短而遗传多样性又极其丰富，所以花粉和种子的保存对完善药用植物种质资源具有重要的意义。

2.2 材料的预处理

超低温保存成功的关键在于药用植物组织含水量的多少。低温冰冻及化冻过程会使保存材料细胞内水结冰、降低细胞的含水量，对材料进行适当脱水是植物组织保存的关键[3]。低温驯化、黑暗培养等也是超低温保存常用的预处理方法。

2.2.1干燥 材料含水量是决定超低温保存能否成功的关键。含水量过高植物内易形成冰晶造成机械性损伤；含水量过低会对植物组织细胞内的束缚水进行破坏，造成组织死亡。适当的脱水能减少细胞的损害，提高材料成活率[5]。常维霞等[6]对油茶花粉含水量的超低温保存效果进行了研究，结果表明经脱水处理后，花粉活性随含水量降低而降低，液氮保存后的花粉萌发率均先升高后下降，油茶花粉经过3～5 h脱水，含水量为14.46%～15.70%时保存效果最好。曾琳等[7]研究表明，降香黄檀种子超低温保存后发芽率和生活力随着含水量的变化而变化，当降香黄檀种子含水量由 15.04%降至 8.14%时，其发芽率由82.67%下降至18.35%，生活力由 85.0%降至25.0%，超低温保存效果最好的条件是种子含水量为 15.04%。在花粉的保存中也有类似研究，当桃叶卫矛花粉在含水量为14.56%的初始状态时，液氮保存后的花粉全部死亡，当含水量降低到4.14%～12.32%时，花粉的萌发率呈现逐渐升高的趋势，而当花粉含水量降至1.67%时，花粉萌发率又开始下降，最终全部死亡[8]。因此，含水量与超低温保存材料的萌发率关系紧密，是超低温保存能否成功的关键因素。

2.2.2低温驯化及暗培养 低温锻炼又称冷驯化，通常是指将生物材料置于4～10 ℃低温处理，可以提高药用植物的抗冻能力。低温可以激活药用植物体内的抗寒机制，通过一定时间的低温暗培养驯化，可以有效提高细胞膜磷脂的不饱和程度和药用植物体内多胺和脯氨酸的含量，诱导细胞产生抗冻蛋白[9]，发生保护性脱水，提高植物的成活率。但是低温驯化时间过长会造成的试管苗成活率下降、叶片枯黄脱落等现象，可能是由于在冰箱的低温暗培养中，植物缺少光照、生活力减弱，导致植物超低温保存后成活率下降。研究表明香石竹植株在4～8 ℃驯化后冻存，成活率达70%～80%[10]；怀山药在低温锻炼7 d时成活率达最大值[11]；薄涛等[12]将继代生长30 d的蛇莓试管苗于4 ℃冰箱中低温锻炼0、1、2、3、4、5、6周，经超低温保存后发现，锻炼4周时蛇莓茎尖保存后成活率达到(28.00±5.70)%，未经锻炼的茎尖存活率仅为(7.00±2.74)%，但随锻炼时间延长，保存后茎尖存活率呈下降趋势，锻炼5～6周时，试管苗逐渐变黄脱叶，成活率显著下降。因此，要合理控制低温驯化时间。

2.3 保护剂的使用

药用植物材料的脱水时间具有种间特异性，根据不同药用植物的保存部位，通过改变装载时间、冰冻保护剂、脱水时间、化冻方法等可得到适宜的冷冻保存方法。冷冻保护剂的使用是为了避免在冷冻过程中形成细胞内冰晶，同时可以弱化水结晶,确保溶液呈高冷状态，但其对植物均有一定的毒害作用，作用时间过长会造成细胞过度脱水，成活率下降[13]。目前应用最广泛的冷冻保护剂是PVS2。

李俊慧等[14]将不同玻璃化液处理的香蕉茎尖超低温保存后的再生率进行对比，发现PVS2效果最好，其次是PVS4，但PVS4处理的结果稳定性不好。枇杷茎尖的超低温保存结果表明，茎尖在PVS2处理50 min时成活率最高，可达50.3%，少于50 min时由于茎尖脱水不完全而成活率不高，超过50 min则受到PVS2毒害也不易成活[15]。在马铃薯茎尖的研究结果类似，王家福等[16]发现在60%PVS2处理30 min后的茎尖成活率最高，达到71.6%，处理40 min后成活率为70.4%，50 min的成活率为68.3%。而对樱桃砧木马哈利离体茎尖的超低温保存研究结果表明PVS3效果较好[17]。不同植物所用冰冻剂的作用时间以及浓度等都需要深入研究。

2.4 冻存方法

药用植物超低温保存冻存方法有两步降温法、逐步冷冻法、干燥冻存法、脱水冻存法、玻璃化法、包埋玻璃化法等。各种冷冻方法有各自的优缺点，在保存实验过程中应根据不同材料来确定冷冻方法。如对菊花茎尖来说，最适宜的方法可能是小液滴快速冷冻法，而甘薯最适宜的超低温保存方法是玻璃化法。

2.5 化冻方法

据目前的研究来看，大多数药用植物超低温保存材料选择快速化冻效果较好，化冻过程中随着温度的升高细胞内易形成二次结冰。冰晶最易在-50～-10 ℃时形成，此时如果解冻速度太慢，细胞内更多的自由水会发生重结晶，从而加大对细胞的损伤。选择适当的解冻方法可提高超低温保存药用植物的萌发率和复苏率。尚晓倩等[18]对超低温保存后的牡丹花粉采用4种化冻方法，即分别采用自来水冲洗10 min、室温(24 ℃)化冻、30 ℃温水浴及40 ℃温水浴解冻，结果表明30 ℃温水浴化冻的花粉萌发率显著高于其他几种方式。库车小白杏茎尖愈伤材料在室温下解冻的成活率最低，仅为6%，而采用40 ℃水浴5 min解冻和4 ℃冰箱解冻的成活率较高，分别为90%和84%[19]。大叶黑桫椤在室温下化冻的孢子萌发率为47.6%～65.3%，明显高于37 ℃水浴化冻条件下的孢子萌发率[20]，而怀山药茎尖在40 ℃化冻温度时复苏率最高[11]。对于超低温保存的扁桃晚丰18号的花粉来说，最佳的化冻方式是35 ℃解冻70 s，花粉萌发率高达63.09%[21]。

3 药用植物超低温保存现状

超低温保存作为植物离体保存最重要的技术之一，国内外已对数百种植物材料进行了超低温保存[22]。涉及保存的材料也很众多，有原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、体细胞胚、花粉、茎尖分生组织等，甚至植株幼苗[2]。目前，中国、美国、法国、德国等也已建立植物种质资源的超低温保存库，对农作物和园林植物的材料进行超低温保存，并取得了较为理想的效果。但是，超低温应用范围还非常有限，尤其在药用植物的保存方面报道较少，更没有专门的药用植物超低温种质资源库。已知超低温保存成功的药用植物材料有百子莲胚性愈伤组织、大苞鞘石斛原球茎、人参丛生芽、金银忍冬花粉及茎尖、降香黄檀种子等[23-36]，但还有很多珍稀濒危药用植物尚无进行超低温保存的报道。近年来，学者们对超低温保存前后药用植物材料做了一些对比研究和分析，目前的研究主要集中在材料形态[23-37]、细胞[20，36]等方面，对不同基因型药用植物、不同保存类型材料及超低温保存机理研究较少，偶见对保存材料进行分子和遗传稳定性[1，38]考察的文献，缺乏真正系统的深入研究。药用植物超低温保存常用方法和路线见图1。

图1 药用植物超低温保存常用方法和路线

4 问题与展望

超低温保存已成为目前种质资源保存的研究热门技术[39-41]。大规模使用超低温技术还存在以下问题：1)超低温保存技术应结合植物的种间差异性研究；2)冰冻保护剂的使用及优化；3)化冻处理方法的研究；4)影响因素较多；5)超低温理论化的进一步发展。但随着低温生物学的发展以及各学科相互借鉴和渗透，超低温保存技术的研究将会不断完善和深入。超低温保存药用植物种质资源最主要的目的是保证其遗传稳定性，控制遗传性状的基因不发生突变，因此保存前后材料的遗传稳定性对比研究非常重要。对药用植物而言，超低温保存后复苏材料的有效成分和药理活性的对比研究也将是未来超低温保存的重要考察点。另外，虽然理论上超低温技术能够实现种质资源的“永久保存”，但由于超低温保存技术发展时间较短，其保存的极限时间仍需更长的时间来验证。

药用植物种质资源多是重要的特有野生资源，其保存工作尤为重要。超低温保存技术是现今最经济、安全、有效的保存手段，扩大其应用范围是保护珍稀濒危药用植物种质资源的必然趋势，成立国家和地方药用植物种质资源超低温保存库势在必行。未来应深入探究超低温保存的原理，将超低温保存技术与生产实践有效的结合，参与药用植物脱毒栽培、品种选育及种质创新工作以解决珍稀濒危药用植物种质保存工作中的难题。