克氏原螯虾春季烂尾病的初步研究

刘张淮，王家军，张荧荧，朱春艳，王晓英

（宝应县水生动物疫病与预防控制中心，江苏 宝应 225800）

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）俗称淡水小龙虾，属十足目，螯虾科，原螯虾属，该虾昼伏夜出，喜欢栖息于静水或缓流水体的水草茂盛处[1]。克氏原螯虾广泛分布于我国江苏、安徽等地，现已成为我国养殖范围最广的淡水螯虾养殖种类[2-3]。然而，随着我国克氏原螯虾人工养殖热潮兴起，相关病害的发生也越来越普遍，国内外有许多关于克氏原螯虾病原的报道，主要病原有嗜水气单胞菌[4]、螺原体[5]和白斑综合征病毒[6-8]等。

2020年4月，江苏宝应一家龙虾养殖场发生克氏原螯虾烂尾病，患病虾可以正常摄食，除尾扇部分溃烂外，体表无明显病变。为防止病害的继续发展，作者立即组织相关人员采集病虾样本，带回实验室作进一步研究。

1 材料和方法

1.1 样品

患病虾采集于扬州市宝应县某龙虾养殖场，平均体质量20 g左右，体长10 cm左右。

1.2 试剂与仪器

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基；革兰氏染色试剂盒；动物用药敏分析试剂板；Protease K、2K DNA Marker、ddH2O 和 2×EasyTay PCR SuperMix；DNA提取试剂盒。

BX53光学显微镜、SHP-160型生化培养箱、THZ-82B型空气摇床、洁净工作台、细菌自动鉴定系统；干式恒温器、MIKRO200R型台式高速冷冻离心机、S1000型PCR仪、BG-Power 600型电泳仪、INFINITY-3026型凝胶成像系统。

1.3 细菌分离

用无菌接种针蘸取病虾尾部病灶部位于营养琼脂平板上划线，于30℃培养箱过夜培养，进行3次分离纯化，得到两株优势菌。同时，将分离出的菌落接种于营养肉汤培养基，于30℃空气摇床中过夜培养，保存菌液。

1.4 形态观察和细菌初步鉴定

观察培养基平板上菌落形态，对分离出的两株优势菌进行革兰氏染色，于1 000倍光学显微镜下观察，比较菌株形态差异。使用细菌自动鉴定系统对分离出的两株细菌进行初步鉴定。

1.5 DNA提取

收集菌液，12 000 r/min离心2 mins，弃去上清，然后按照DNA提取试剂盒操作说明提取细菌DNA。

1.6 16S rRNA基因测序和分析

使用16S rRNA通用引物F（5’-AAACTCAAAG GAATTGACGG-3’）和 R（5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’）对提取出的细菌DNA进行PCR扩增，参考彭宣宪等人方法[9]。PCR反应体系25 μL：模板1 μL，正反向引物各 1 μL，SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性 3 s、56 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 10 s，35次循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR扩增产物一部分进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，另一部分送往上海生工生物股份有限公司进行16S rRNA基因测序。

1.7 药敏试验

使用动物用药敏分析试剂板检测两种细菌对8种常见抗生素的药物敏感性，药敏结果判定参照《抗微生物敏感试验的执行标准》（CLSI）[10]。

2 结果

2.1 细菌分离

从患烂尾病克氏原螯虾尾部病灶分离出两株细菌，分别编号为S1和S2。

2.2 形态学观察

如图1所示，菌株S1菌落为圆形，淡黄色，直径约为1~2 mm；S2菌落为圆形，灰白色，直径约为1~2 mm。S1和S2均为革兰氏阴性，短杆状。

图1 菌株S1和S2的形态特征

2.3 细菌初步鉴定结果

将S1和S2两种菌株接种到生化反应板中，30℃培养24 h后，使用细菌自动鉴定系统进行初步鉴定。结果如表1所示，通过相关理化反应，S1初步鉴定为嗜水气单胞菌，S2为弗氏柠檬酸杆菌。

2.4 16S rRNA基因测序结果

如图2所示，菌株基因片段大小为520 bp左右，与理论值一致。同时将16S rRNA基因序列提交BLAST进行比对，与部分模式菌株比对结果如表2所示，菌株S1与嗜水气单胞菌相似性为99.36%，S2与弗氏柠檬酸杆菌相似性为100%，综合上述结果，可确定菌株S1为嗜水气单胞菌，菌株S2为弗氏柠檬酸杆菌。

表1 菌株S1和S2的初步鉴定

图2 16S rRNA基因序列扩增结果

2.5 药敏试验

如表3所示，药敏试验结果表明两种菌株均对恩诺沙星和硫酸新霉素高度敏感，对磺胺类药物均不敏感。此外，S1对甲砜霉素、氟苯尼考和盐酸多西环素高度敏感；S2对氟苯尼考和盐酸多西环素中度敏感。

表2 菌株S1和S2的16S rRNA基因序列比对相似性

表3 菌株S1和S2的药敏特性

3 讨论

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为弧菌科气单胞菌属，是一种革兰氏阴性菌，可以引起多种淡水养殖鱼类感染，包括草鱼、鲢、鳙、鲫、鳊、鲤等。由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症已成我国水产养殖业危害淡水鱼种类最多、分布地域最广、流行季节最长、造成损失最大的一种急性传染病[3，11]。随着近几年甲壳动物，如虾、蟹人工养殖的增多，甲壳动物感染嗜水气单胞菌引起大批死亡的报道也越来越多，如2010年，浙江安吉克氏原螯虾养殖死亡严重，经细菌分离鉴定，病原菌为嗜水气单胞菌[4]；2010年，嗜水气单胞菌引起汕头市牛田洋水产养殖区锯缘青蟹患病死亡[12]。

弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）为肠杆菌科枸橼酸杆菌属，是一种革兰氏阴性菌，常见于粪便和尿液中，可以作为一种粪便污染的微生物学指标[13]。弗氏柠檬酸杆菌作为人类肠道中的正常菌群，是一种兼性厌氧的条件致病菌，最早报道与人的腹泻有关[14]。近年来，在鱼类和虾蟹类养殖上也有报道，如2016年，柳州市柳城县一家养殖场罗非鱼大量死亡，经鉴定后确定病原菌为弗氏柠檬酸杆菌[15]；2012年，弗氏柠檬酸杆菌引起安徽省全椒县两家克氏原螯虾稻田养殖场爆发性死亡[16]。

嗜水气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌都是水产动物病害的常见病原，广泛存在于自然水体中。本实验对春季克氏原螯虾烂尾病进行了基础性探索，具体关于克氏原螯虾烂尾病的病原菌判定还需要后续的深入研究。

4 结论

目前，作者从克氏原螯虾烂尾病灶处分离出嗜水气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌两种细菌，在养殖生产中可以使用恩诺沙星和硫酸新霉素对其进行防治。