雷公藤内酯醇对荷卵巢癌大鼠的抑瘤效应及其对免疫系统的影响

张浩　马犇　程杨

摘要 目的：研究雷公藤内酯醇（TP）用于荷卵巢癌大鼠的抑瘤效应及其对免疫系统的影响。方法：选取性SD大鼠作为实验动物，皮下注射卵巢癌细胞后得到荷卵巢癌大鼠，分为腹腔注射生理盐水的对照组、低剂量TP组、中剂量TP组、高剂量TP组。药物干预后测定肿瘤的质量和体积、肿瘤组织中抑癌基因的表达量、外周血中免疫细胞因子的水平。结果：低剂量、中剂量、高剂量TP组大鼠的肿瘤质量与体积、外周血中白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-17（IL-17）、转化生长因子β1（TGF-β1）的水平均明显低于对照组，肿瘤组织内PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表达量以及外周血中干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平均明显高于对照组且TP剂量越大，肿瘤质量与体积、外周血中IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低，肿瘤组织内PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表达量以及外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高。结论：TP用于荷卵巢癌大鼠具有显著的抑瘤效应，能够抑制肿瘤生长、增加抑癌基因表达并调节抗肿瘤免疫应答。

关键词 卵巢癌;雷公藤内酯醇;荷瘤鼠;抑癌基因;免疫应答

Antitumor Effects of Triptolide on Tumor Ovarian Cancer Bearing Rats and Effects of Triptolide on Immune System

ZHANG Hao，MA Bei，CHENG Yang

（ Department of Gynaecology，the First People′s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510180，China）

Abstract Objective：To study the antitumor effects of Triptolide （TP） used in rats with ovarian cancer and its influence on the immune system.Methods：Female SD rats were selected as experimental animals，and ovarian cancer-bearing rats were obtained after subcutaneous injection of ovarian cancer cells.They were divided into a model group，a low-dose TP group，a middle-dose TP group，and a high-dose TP group injected with physiological saline.After drug intervention，the weight and volume of the tumor，the expression of tumor suppressor genes in the tumor tissue，and the content of immune cytokines in the peripheral blood were measured.Results：Tumor weight and volume，interleukin-4 （IL-4） in peripheral blood，interleukin-17 （IL-17），and transforming growth factor β1 （TGF-β1） in rats in the low-dose，middle-dose，and high-dose TP groups were significantly lower than the model group，and the expression of PTEN，ST7L，Bax，TIMP1，E-cadherin mRNA in tumor tissues and interferon-γ （IFN-γ） and tumor necrosis factor α （TNF-α） in peripheral blood were significantly higher than the model group.The greater the TP dose，the lower the tumor weight and volume，and the content of IL-4，IL-17，and TGF-β1 in the peripheral blood，the higher the mRNA expression of PTEN，ST7L，Bax，TIMP1，E-cadherin in the tumor tissue，and the higher the content of IFN-γ and TNF-α in peripheral blood.Conclusion：TP has a significant tumor suppressing effects on ovarian cancer-bearing rats，which can inhibit tumor growth，increase tumor suppressor gene expression and regulate anti-tumor immune response.

Keywords Ovarian cancer; Triptolide; Tumor bearing mice; Tumor suppressor gene; Immune response

中圖分类号：R284;R711文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.011

卵巢癌是临床上常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，早期诊断难度大，确诊时多已发展至中晚期，通过细胞减灭术、放化疗虽然能够在一定程度上杀伤癌细胞、控制肿瘤病情发展，但整体预后并不理想、5年生存率不足30%[1-2]。近年来，越来越多的学者致力于探寻卵巢癌质量的新药物。雷公藤内酯醇（TP）是从中药材雷公藤中分离得到的活性成分，属于二萜内酯类化合物，具有广泛的抗肿瘤及免疫调节活性[3]。已有细胞实验研究证实，雷公藤内酯醇对离体培养卵巢癌的增殖具有显著抑制作用[4]，但雷公藤内酯醇是否能够在活体卵巢癌病灶中发挥抗肿瘤作用仍不明确。我们以荷卵巢癌大鼠为研究模型，具体分析了雷公藤内酯醇的抑瘤效应及其对免疫系统的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取由大学实验动物中心提供雌性SD大鼠，2月龄、体质量220～300 g，动物许可证号：SYXK（粤）2015-0104。饲养环境：温度（23±1.3）℃，湿度（50±2）%，12 h/12 h昼夜交替。

1.1.2 药物

雷公藤内酯醇购买于美国Sigma公司，批号：283922。

1.1.3 试剂与仪器

卵巢癌NUTU-19细胞株（ATCC公司，美国，货号：5346-2），细胞培养所用RPMI1640培养基（批号：46522）、胎牛血清（货号：Ta3695）、胰蛋白酶（货号：694358）均购于美国Hyclone公司，基因mRNA表达量检测所用试剂盒（北京康为世纪公司，批号：1675-11），酶联免疫吸附试验（Elisa）试剂盒（上海西唐生物公司，批号：436-3）。

1.2 方法

1.2.1 分组及荷卵巢癌大鼠制作

荷卵巢癌大鼠随机分为对照组、低剂量TP组、中剂量TP组、高剂量TP组，复苏卵巢癌NUTU-19细胞株后用含有10%胎牛血清的RMPI1640进行培养，扩增后用胰蛋白酶进行消化，重悬细胞后加入适量RMPI1640、将细胞密度调节至2×107/mL;取0.2 mL细胞悬液、接种在大鼠右侧腋窝的皮下，继续喂养5～7 d后形成0.4 cm×0.4 cm的肿瘤病灶，用于后续分组及药物干预。

1.2.2 干预方法

对照组每天给予生理盐水2 mL腹腔注射，低剂量TP组、中剂量TP组、高剂量TP组分别按照0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg的剂量将雷公藤内酯醇溶于2 mL生理盐水并进行腹腔注射。4组大鼠均连续给药5 d。

1.2.3 检测指标与方法

肿瘤质量与體积的测定：给药5次后，第2天采用颈椎脱臼法处死大鼠，分离肿瘤组织并在电子天平上称重，而后测量肿瘤组织的长径a和短径b、按照公式ab2/2计算肿瘤体积。

肿瘤组织中基因 mRNA表达量的测定：完成肿瘤质量与体积的测定后，按照试剂盒Ultrapure RNA Kit进行操作并提取肿瘤组织中的RNA，而后按照试剂盒SuperRT One Step RT-PCR Kit配置反转录体积、合成cDNA;取cDNA与2×Taq Plus MasterMix反应液及引物混合为PCR反应体系，按照95 ℃ 20 s、特异性退火温度15 s、72 ℃ 25 s的程序重复40次，得到反应曲线及循环阈值（Ct）后按照公式2-△△Ct计算基因的mRNA表达量。PCR引物序列及退火温度见表1。

外周血中细胞因子的测定：处死大鼠后，收集外周血标本，采用Elisa试剂盒测定干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-17（IL-17）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，组间计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用完全随机设计的方差分析、两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠的肿瘤质量与体积 与对照组比较，低剂量、中剂量、高剂量TP组大鼠的肿瘤质量与体积均明显降低且TP剂量越大，肿瘤质量与体积越低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2 4组大鼠肿瘤组织内抑癌基因的表达量 与对照组比较，低剂量、中剂量、高剂量TP组大鼠肿瘤组织内PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表达量均明显升高且TP剂量越大，肿瘤组织内PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表达量越高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3 4组大鼠外周血中免疫细胞因子的水平 与对照组比较，低剂量、中剂量、高剂量TP组大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α的水平均明显升高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平均明显降低且TP剂量越大，外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

卵巢癌的早期症状不典型、诊断率较低，多数患者确诊时已经发展至中晚期并错过了根治性切除的时机，此时只能选择细胞减灭术、放化疗等治疗手段来杀伤癌细胞、延缓肿瘤的病程，但整体预后不理想且5年生存率较低。近年来，中药材的抗肿瘤作用受到了越来越多的关注，多种中药材被证实具有抗肿瘤活性，其中TP是中药材雷公藤中的活性提取物，在多种恶性肿瘤细胞中被证实具有抗肿瘤、免疫调节活性[5-6]。细胞实验研究结果表明，TP能够明显降低离体培养卵巢癌细胞的增殖活力，能够在离体水平发水抗肿瘤效应[7]，但TP在卵巢癌活体病灶内的抗肿瘤效应尚未见明确报道。在本研究中，为了明确TP在卵巢癌活体病灶内的抑瘤效应，我们采用皮下注射卵巢癌细胞的方式建立了荷卵巢癌大鼠模型并以该模型为研究对象，通过腹腔注射TP的方式进行干预，由药物干预后肿瘤质量和体积的分析可知：TP组大鼠的肿瘤质量与体积均明显降低且TP剂量越大，肿瘤质量与体积越低。这一结果说明TP在荷卵巢癌大鼠体内具有抑瘤效应，能够以剂量依赖性的方式降低肿瘤的质量和体积。

在卵巢癌的病理进程中，局部病灶内抑癌基因表达缺失与癌细胞增殖、侵袭活力的增强有关，多种抗肿瘤药物能够以抑癌基因为作用表达、通过激活抑癌基因来抑制癌细胞的增殖、侵袭。PTEN、ST7L、Bax是与卵巢癌细胞凋亡直接相关的抑癌基因，PTEN的编码产物具有磷酸酶活性，在催化MAPK、PI3K、AKT等信号分子发生去磷酸化的基础上抑制信号通路活化、诱导细胞发生凋亡[8];ST7L基因與Wnt2成簇表达，表达产物能够使细胞周期发生停滞并迅速进入凋亡程序[9-10];Bax基因的编码产物属于Bcl-2家族，能够在线粒体膜上拮抗Bcl-2的活性并增加线粒体内细胞色素C的释放，进而通过细胞色素C的活性来介导细胞凋亡的级联放大[11]。TIMP1、E-cadherin是与卵巢癌细胞侵袭密切相关的抑癌基因，前者通过拮抗多种蛋白酶水解细胞外基质的活性来抑制癌细胞侵袭，后者通过增强细胞间极性及黏附性来抑制癌细胞侵袭[12-13]。本研究对荷卵巢癌大鼠肿瘤组织中上述抑癌基因表达的分析发现：TP组大鼠肿瘤组织内PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表达量均明显升高且TP剂量越大，肿瘤组织内PTEN、ST7L、Bax、TIMP1、E-cadherin的mRNA表达量越高。说明TP在荷卵巢癌大鼠体内具有增加抑癌基因表达的效应，通过改变抑癌基因的表达能够诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭，进而发挥抑制肿瘤生长的抑瘤效应。

当卵巢癌进展至中晚期后，患者体内存在显著的抗肿瘤免疫应答紊乱，癌细胞容易发生免疫逃逸并不断生长。CD4+T细胞是在体内发挥抗肿瘤免疫应答效应的重要细胞，能够分泌不同的免疫细胞因子并在抗肿瘤免疫应答中发挥不同作用[14]。Th1是介导细胞免疫的CD4+T细胞亚群，通过分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子来杀伤癌细胞[15];Th2是介导体液免疫的CD4+T细胞亚群，通过分泌IL-4等细胞因子一方面能够使B细胞发生活化并参与体液免疫，另一方面也能使Th1的分化受到抑制并削弱Th1所介导的抗肿瘤效应[16];Th17是特异性分泌IL-17的CD4+T细胞亚群，该细胞亚群所分泌的IL-17具有促进肿瘤细胞迁移、侵袭的效应[17];Treg是具有免疫抑制活性的CD4+T细胞亚群，通过分泌TGF-β1等抑制性细胞因子来使机体的抗肿瘤免疫应答活性减弱[18]。本研究对荷卵巢癌大鼠外周血中上述免疫细胞因子水平的分析发现：TP组大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α的水平均明显升高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平均明显降低且TP剂量越大，外周血中IFN-γ、TNF-α的水平越高，IL-4、IL-17、TGF-β1的水平越低。这一结果说明TP在荷卵巢癌大鼠体内具有调节抗肿瘤免疫应答的作用，通过增加Th1细胞因子的分泌并减少Th2、Th17、Treg细胞因子的分泌来增强抗肿瘤免疫应答。

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（2018-08-22收稿 责任编辑：张雄杰）

基金项目：广东省医学科研课题（A2013588）作者简介：张浩（1978.01—），男，本科，副主任医师，研究方向：中医妇科肿瘤临床工作，E-mail：zhalidortor@163.com