不同培养基对云烟97变异株腋芽培养的效应研究

刘瑞婕　张丽琼　李炳　陈佳荷　张子怡

摘 要：以云烟97变异株腋芽为外植体，研究不同培养基对云烟97变异株组织培养的效应。结果表明，初代培养基MS+6-BA  2.0 mg/L分化成芽率高达75 %;初代培养基MS+6-BA  1.0 mg/L，继代培养基MS+6-BA  1.0 mg/L +NAA  0.2 mg/L分化成芽率高达77 %;初代培养基MS+6-BA  2.0 mg/L，继代培养基MS+6-BA  3.0 mg/L分化成芽率高达76 %。故利用植物快繁技术培养云烟97时，要根据初代培养基选择相应的继代培养基。

关键词：烟草 云烟97 变异株 腋芽 组织培养

中图分类号：S572           文献标志码：A

Effects of Different Media on Culture of Axillary

Buds of Yunyan 97 Mutant

LIU Ruijie1，ZHANG Liqiong1，2*， LI Bing1， CHEN Jiahe1， ZHANG Ziyi1

（1School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang，Shaanxi 725000，China;2 Research Center for Rural Revitalization in Southern Shaanxi， Ankang 725000，China）

Abstract： Axillary buds of Yunyan 97 mutant were used as explants to study the effects of different media on axillary buds formation of Yunyan 97 mutant. Results showed that the bud formation rate in the initial medium： MS+6-BA 2.0 mg/L was up to 75 %; in the initial medium： MS+6-BA 1.0 mg/L and the subculture medium： MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L reached 77 %; in the initial medium： MS+6-BA 2.0 mg/L and subculture medium： MS+6-BA 3.0 mg/L reached 76 %. It is suggested to select corresponding subculture medium based on initial medium to culture Yunyan 97 by rapid propagation technology.

Key words： Yunyan 97 mutant; axillary bud; culture medium

烟草是安康市镇平县主要的经济作物，也是植物生物技术研究的重要模式植物[1]，一直是植物分子遗传学、植物生物工程学的主要研究对象[2]。Carlson等[3] 试验得到世界上第1个杂种植株。由于传统种子优良性状退化，因此通过植物组织培养可以培养出大量植株。不断优化组织培养条件就成为不同烟草遗传操作中不可缺少的基础研究[4-6]。例如：在2001年10月，1株超大变异烟草在陕西旬阳被发现，该变异株烟草比普通株有更大生长优势，陈刚[7]对这株变异烟草进行组织培养并进行测量分析来判断这株是否为变异株。何余勇[8]等为了优化云烟97变异株培育的快繁体系，采用不同激素浓度、配比处理云烟97变异株，结果显示，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA  0.2 mg/L，是诱导愈伤组织和不定芽分化的最佳培养基，1/2MS+6-BA  0.1 mg/L+IBA  0.5 mg/L是最佳诱导生根培养基。

近几年，陕西省镇平县把烟草作为农民经济收入的主要来源，经过政府支持，烤烟种植取得成功，填补烤烟在该县种植空白，带动了经济发展。2016年9月在陕西镇平县烟田中发现的2株云烟97超大型变异株，比当地栽培的云烟97植株高，叶片产量高，同时还具有其他的优良性状，整株无病虫害，从该株上采的烟叶质量上乘。为了保存这一优良的烟草种质资源，本研究以云烟97变异株腋芽为材料，进行了初代和继代培养研究，探索云烟97组培快繁适宜的培养基配方。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云烟97超大型变异株腋芽。

1.2 试验方法

以云烟97变异株腋芽为外植体，先用自来水冲洗掉外植体上面的泥土砂砾，再用蒸馏水冲洗3遍，放在干净的烧杯中，在无菌操作室里面用70 %的酒精浸泡30 s，再用无菌水冲洗4遍。然后放入干净的烧杯中用0.1 %的升汞浸泡6 min，再用无菌水冲洗5次，最后用刀片把外植體切成1 cm2小块接种到培养基中。试验采取诱导培养基MS及添加不同植物激素组合的固体培养基（表1）上诱导愈伤组织，每个三角瓶（100 mL）中接种四五块叶片外植体，每处理30个重复。外植体培养条件为25 ℃，2000 Lux，每天14 h光照。

将愈伤组织上分化的叶片切成1 cm2大小转移到继代培养基（表2）上诱导芽的分化和根的形成，每种处理10个重复，诱导条件为25  ℃，光照2000 Lux，14 h/d。

1.3 数据处理

试验中，设置不同激素组合，观察对云烟97变异株组织培养的影响，记录试验数据，并对实验数据进行分析，按照下面数据计算：

愈伤组织形成率（%）=形成愈伤组织外植体数/外植体总数×100。

分化成芽率（%）=形分化明显芽数/分化芽点总数×100。

污染率（%）=污染的外植体数/总外植体数×100。

褐变率（%）=褐变的外植体数/总外植体数×100。

2 结果分析

2.1 初代培养

接种后第15 d   3个处理的外植体生长表现出明显差异（表3）。比较第15 d至31 d的观察结果，处理CK生长无明显变化;处理A和处理B均能诱导出愈伤组织和分化出丛生芽，但处理B生长速度高于处理A。表明以云烟97腋芽为外植体快速繁殖时，初代培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L。

由生长情况分化出芽和褐变统计分析可知，随着6-BA浓度的增加，褐变率升高，分化成芽率升高（表4），表明高浓度的6-BA能促进分化，同时也会加快外植体的褐变，故在培养时应及时转接。

2.2 继代培养

继代培养5 d后，处理A5和处理A11均比其他处理先分化出芽（表5），具有相同继代培养基的处理B5和处理B11则没有;继代培养第25 d，处理A2、B5、B9除分化出芽外，还分化出根（表5），与具有相同继代培养的处理B2、A5、A9则无根。即不同初代培养基培养的材料，在相同继代培养基上表现出差异性，表明不同培养基可能造成诱导分化的叶片生理上有差异，从而导致继代培养表现不同。

从总体趋势上看，相同浓度NAA条件下，处理A组的分化成芽率均低于处理B组（表6），处理A组和处理B组结果均显示NAA浓度为0.2 mg/L时分化成芽率高于不加NAA和NAA浓度为0.5 mg/L的培养基。

相同浓度6-BA条件下，处理A组的分化成芽率均低于处理B组（表7），处理A组中，6-BA浓度为1.0 mg/L和3.0 mg/L时分化成芽率高于不加6-BA和6-BA浓度为2.0 mg/L的培养基。处理B组中，6-BA浓度为3.0 mg/L的分化成芽率较高，其次是不添加6-BA的处理。表明初代培养基的不同，诱导出的愈伤组织在生理上有差异性，导致相同继代培养基培养的愈伤组织分化成芽率不同。

从初代培养到继代培养，处理A5、处理A11、处理B10的分化成芽率较高，超过了70 %，即初代培养基为MS+适宜的培养基方案为：初代培养基为MS+1.0 mg/L，继代培养基NAA浓度为0.2 mg/L、6-BA浓度为1.0 mg/L或3.0 mg/L;初代培养基为MS+2.0 mg/L，继代培养基NAA浓度为0.2 mg/L、6-BA浓度为3.0 mg/L。

3 讨论

在本次试验中，分别探讨了6-BA浓度对愈伤组织诱导的影响，6-BA、NAA浓度对诱导芽分化和伸长影响等进行了研究。结果发现，初代培养中，处理CK分化成芽率为25 %，处理CK与处理A、B相比较，处理CK的分化成芽率最低。处理A次之，分化成芽率为67.5 %。处理B的分化成芽率最高，分化成芽率为75 %。说明 MS+6-BA 2.0 mg/L培养基诱导率比较高当，这与陈刚的MS+6-BA 2.0 mg/L结果一致[7]。

继代培养中，NAA浓度为0时，分化成芽率比较低，当0.2 mg/L NAA浓度时，分化成芽率升高，但当0.5 mg/L NAA浓度时，分化成芽率反而下降了，所以0.2 mg/L NAA浓度时，分化成芽率为 68 %;当6-BA浓度为0时，分化成芽率比较低，1.0  mg/L 6-BA浓度时，分化成芽率升高为63 %。2.0 mg/L 6-BA浓度时，分化成芽率为59 %，6-BA浓度为3.0 mg/L，分化成芽率为76 %。因此当6-BA浓度为3.0 mg/L，分化成芽率比较高;当1.0  mg/L 6-BA濃度时，NAA浓度为0.2 mg/L时，分化成芽率为77 %，分化成芽率最高，这与陈刚的结果一致[7]。在B组处理中，3.0 mg/L的6-BA浓度时，0.2 mg/L 的NAA浓度时，分化成芽率为69 %。

4 结论

本研究在25 ℃，2000 Lux，每天14 h光照条件下培养云烟97变异株腋芽外植体。在初代培养中，MS+6-BA 2.0 mg/L培养基诱导效果优于其他培养基组合，因此它是适宜诱导愈伤组织的培养基。在初代培养基MS+6-BA 1.0 mg/L培养的基础上，继代培养适宜的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;在初代培养基MS+6-BA 2.0 mg/L培养的基础上，继代培养适宜的培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L。

参考文献

[1]     邵宏波，初立业. 烟草组织培养研究的进展[J].国外科技，1991（8）：38-40.

[2]     吴元华. 生物技术在烟草种领域的应用及发展趋势[J].世界烟草动态，1999，7（4）：2-8.

[3]     Carlson P S， Smith H H，Dearing R D. Parasexul interspecific plant hybridlization[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1972（19）：2292-2294.

[4]     战淑敏. 烟草叶组织培养直接获得再生植株[J].莱阳农学院报，1993，10（2）：131-132.

[5]     朱生伟，徐仲，朱祥春，等.烟草叶组织培养再生系统的建立[J]. 吉林农业大学学报，

1998，20（1）：27-29.

[6]     何川生，王晓云，雷永和.烟草快速繁殖及培养的研究[J]. 云南农业大学学报，1998，17

（4）：392-396.

[7]     陈刚. 超大型烟草变异株的抢救性克隆繁育及生物学鉴定[D].西安：西北大学，2003：1-69.

[8]     何余勇，罗定棋，赵磊峰，等.云烟97巨型变异烟株的组织培养与快速繁殖[J]. 中国烟草学报，2013，19（1）：65-69.

基金项目：陕西省大学生创新创业训练计划项目（2017sxjy002）。

作者简介：刘瑞婕（1998-），女，籍贯陕西省榆林市绥德县，本科，主要从事作物栽培研究。

通信作者：张丽琼（1979-），女，籍贯云南省个旧市，副教授，博士，研究方向为土壤物质循环，E-mail：yryzlq@163.com。

收稿日期：2020-04-02