气相色谱嗅闻/质谱联用分析酵母菌发酵酱油中香气物质

何天鹏,赵 镭,钟 葵,史波林,崔 莹,张璐璐,刘龙云,谢 苒,汪厚银

(中国标准化研究院食品与农业标准化研究所,北京 102299)

酱油作为调味品存在历史悠久,早在周朝就有制酱的记载。酱油经过3000多年的传播及演变,已经成为东亚地区的传统调味料之一,并且因其浓郁的鲜味及独特的香气,在西方国家也越来越受欢迎[1]。在发酵过程中,原料、盐水浓度、微生物、发酵时间和发酵温度等都会影响酱油发酵的风味[2-3]。微生物的代谢在酱油发酵过程中起着至关重要的作用,其中酵母菌的存在更是为酱油的增香、增鲜做出了不可替代的贡献。酱油的风味是在发酵过程中缓慢积累形成的,因此在酱油发酵过程中,耐盐性生香酵母菌如鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)的添加,有助于酱油中总酸、总酯及酒精含量的提高,使得酱油的醇香和酯香更加浓郁,风味更加完善[4-6]。

孟琦等人研究表明挥发性硫醇的生成与酵母菌的代谢至关重要[7]。此外,酵母菌的加入,可以明显提高酱油中酮类物质的含量,而酮类物质对“蘑菇味”有着极大贡献,因此酵母菌是酱油风味形成的关键因素之一;在酱油酿造过程中筛选出更具产香优势的酵母菌株已成为酱油酿造业的必然趋势[8-10]。但筛选出的优势产香酵母菌是否适合酱油酿造的工业化生产,如何鉴定分析其优势特点,从而加以印证其产香优势,为目前酱油酿造行业亟待解决的问题。

固相微萃取(SPME)结合气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O/MS)技术在食品中的应用已经很普遍。与溶剂萃取、溶剂辅助蒸发萃取以及动态顶空萃取相比,SPME不需溶剂、操作简便、仅需少量样品,实验过程中没有副产物生成。因此,针对以上问题,本次研究采用SPME联合GC-O/MS方法对酱油中的挥发性香气物质进行分离检测。在通过RI(retention index)、MS及嗅闻结果对酱油样品中香气物质定性分析的同时,结合OAV(odor activity value)的计算,确定三种酱油中的关键香气物质。再通过将多维影响参数进行降维,从而选取出最主导影响因素的PCA(principal component analysis)分析[11],对各酱油样品中的香气特点进行分析,并结合感官实验加以佐证。本文通过测定不添加酵母菌、由AY型鲁氏酵母菌、由T型鲁氏酵母菌分别酿制的三种酱油样品中风味物质组成,对比分析了由两种鲁氏酵母菌分别酿造酱油的风味特点,从而进一步挑选出产香优势更佳的酱油酿造酵母菌。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AY酱油样品(由AY型鲁氏酵母菌发酵制得),T酱油样品(由T型鲁氏酵母菌发酵制得),空白样品(不添加酵母菌发酵制得),两种酵母菌均为鲁氏结合酵母(Zygosaccharomycesrouxii),三种酱油样品均采用高盐稀态酿造工艺制得 由青岛灯塔酿造有限公司提供;2-甲基-3-庚酮 色谱级,美国Sigma公司;正构烷烃C7～C30色谱级,北京化学试剂公司;正己烷 色谱级,美国Fisher公司。

HH-1数显电子恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;手动固相微萃取进样针及三涂层萃取头(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm 美国SUPELCO公司;7890A-7000B气相色谱-质谱联用仪 配有EI离子源及NIST 08数据库,美国Agilent公司;Sniffer 9000嗅闻检测器 瑞士Brechbuhler公司;毛细管柱:DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国J&W公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 量取10 mL酱油样品于40 mL顶空瓶中,并加入1 μL浓度为0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮。将顶空瓶加盖密封后,放置于55 ℃的恒温水浴锅中,平衡20 min后,插入3涂层固相微萃取进样针,推出吸附涂层,吸附40 min,等待GC进样[12]。

1.2.2 参数设定

1.2.2.1 色谱条件 以高纯氦气为载体,载气流量为1.2 mL/min,分流比为5∶1。进样口温度为250 ℃,解析5 min。DB-Wax(极性柱)升温程序:40 ℃保持3 min;以3 ℃/min升至70 ℃,保持2 min;以10 ℃/min升至240 ℃,保持10 min;DB-5(非极性柱)升温程序:40 ℃保持3 min;以5 ℃/min升至200 ℃;以10 ℃/min升至230 ℃,保持3 min。

1.2.2.2 质谱条件 电子轰击离子源(Electron impact,EI),电子能量70 eV,m/z扫描范围40～500,离子源温度230 ℃,传输线温度为280 ℃。

为了防止嗅闻人员鼻粘膜的干燥,湿空气以30 mL/min的速度被供应到嗅闻口。每组样品进行三次平行检测。

1.2.3 定性与定量分析

1.2.3.1 定性方法 采用NIST 08数据库比对;计算对应化合物保留值(RI),并根据标准品保留值及相关文献进行保留值比对;嗅闻口嗅闻、记录化合物的香气特征三种方法对两种酱油样品中的挥发性香气物质进行定性分析。

化合物的保留值根据C7～C30正构烷烃保留时间公式计算:

式中:n为C7～C30正构烷烃的碳原子个数,t1为Cn的保留时间,T为Cn+1的保留时间,t3为样品中化合物的保留时间(t1≤t3≤T)。

1.2.3.2 定量方法 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)为内标,并根据内标浓度计算样品中挥发性香气物质的浓度:

注:C1为目标化合物的浓度,A1为目标化合物的峰面积,C2为2-甲基-3-庚酮的浓度,A2为2-甲基-3-庚酮的峰面积[12-14]。

1.2.4 感官评价 针对酱油中各风味特点制作相应感官评价表格[15-17]。感官评价小组由8人(4男4女)组成,感官小组成员经由标准品的嗅闻训练,分别对三种酱油样品的香气以及滋味进行感官评定。

表1 香气强度等级打分表Table 1 Aroma intensity rating table

表2 滋味强度等级打分表Table 2 Taste intensity rating table

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件进行多元统计分析,采用Microsoft Excel 2016绘图。

2 结果与分析

2.1 香气活性物质分析

通过图1酱油中香气物质种类的对比可以发现,酵母菌的添加更有助于酵母菌中香气物质的形成。此外,AY型鲁氏酵母菌可以产生更多种类的酯类、醇类、吡嗪类等化合物;T型鲁氏酵母菌在产醛类物质种类方面更具优势,而没有添加酵母菌的空白组样品,在香气化合物生成方面则明显不足,说明AY型和T型两种鲁氏酵母菌的添加,使得酱油中香气物质种类增多。

图1 三种酱油样品中化合物种类柱状图Fig.1 Spices of compounds in three kinds of soy sauce samples

通过对比图2中三种酱油中各类香气物质的含量发现,AY型鲁氏酵母菌在酱油发酵过程中,可以产生较多含量的酯类、酚类、呋喃酮类及醛类化合物;而T型鲁氏酵母菌在产醇类物质方面具有优势。结合空白样品中化合物含量可以看出,AY型鲁氏酵母菌和T型鲁氏酵母菌可以明显提高酿造酱油中挥发性物质含量。结合图1、图2可知,AY型鲁氏酵母菌在产酱油中香气物质的种类及含量上较其他酱油样品具有整体优势。

图2 三种酱油样品中化合物含量柱状图Fig.2 Contents of different species compounds in three soy sauce samples

酯类物质特有的果香、花香、醇类物质的甜香以及吡嗪类物质特有的烤香,为酱油特有的香气做出了巨大贡献。图2结果显示,两种样品中醇类化合物含量皆是最高的。AY样品中的酯类、酸类、呋喃酮类及吡咯类等香气物质的总含量皆高于T样品。苯乙醇、糠醇、乙酸、HEMF、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、4-乙基愈创木酚等关键香气化合物的含量在AY样品中更多[1,18-19]。

通过对AY酱油样品、T酱油样品以及空白酱油样品的分析,共检测挥发性化合物130种,其中挥发性香气化合物共58种,并将挥发性香气物质汇总至表3。AY型鲁氏酵母菌发酵酱油中:酯类11种、醇类12种、酸类2种、吡嗪类7种、呋喃酮类2种、醛类6种、吡咯类2种、酚类7种;T型鲁氏酵母菌发酵酱油中:酯类9种、醇类11种、酸类2种、吡嗪类5种、呋喃酮类2种、醛类7种、吡咯类2种、酚类7种;空白发酵酱油(空白)中:酯类6种、醇类6种、酸类2种、吡嗪类5种、呋喃酮类1种、醛类5种、酚类5种。

本次实验采用DB-Wax与DB-5两种色谱柱对三种酱油样品进行挥发性香气物质检测,并结合RI值与嗅闻结果对检测到的化合物进行更加准确定性。其中,如异戊酸乙酯(果香)、辛醇(金属、烤香)、2,3-二甲-5-乙基吡嗪(爆米花)、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪(熟土豆)、2-丙酰吡咯(烤肉、爆米花)等物质,因为含量较低,不能通过MS检测得到,但却可通过嗅闻结果和RI值对其进行定性分析得到。

在表3中可以发现,对酱油风味起着至关重要的挥发性香气物质,如1-辛烯-3-醇(蘑菇味)有助于醇厚感,2-甲基-1-丁醇(红酒)、4-羟基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(焦糖)是酱油中最重要的香气物质,3-甲基丁醛(杏仁)、苯乙醛(花香)、3-甲硫基丙醛(熟土豆)和2-甲氧基苯酚(烟熏)等化合物是日式酱油中主要的风味物质,而酯类中的己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯;醇类中的丙醇、乙酸以及醛酮类等物质,分别赋予食物水果香、甜香等气味,它们的共同作用为酱油提供了果香、焦香、花香、烤香、爆米花香等特征香气[20-23]。

表3 GC-O-MS分析出的三种酱油中的香气成分Table 3 Analysis of aroma components in two kinds of soy sauce by GC-O-MS

鲁氏酵母菌主要作用于发酵前期,能够代谢葡萄糖,形成高级醇,如异丁醇、异戊醇、甲硫醇、2-苯乙醇等关键香气物质,这些物质都是以α-酮酸为重要中间产物形成的[24-25]。高级醇通过脱羧形成,随后还原相应的α-酮酸。α-酮酸本身主要体现的两个途径中,一条途径是氨基酸生物合成途径,另一条是氨基酸的分解代谢途径,即Ehrlich途径[26]。在Ehrlich途径中,α-酮酸通过消耗和随后的细胞外氨基酸的脱氨基或转氨基形成[27-28]。

由于在盐水发酵期间存在非常高浓度的细胞外氨基酸,所以预计大部分高级醇通过Ehrlich途径形成。此外,Ehrlich途径也是甲硫醇(该物质具有更加可接受的风味)形成的唯一途径[29-31]。而酱油中的关键香气物质之一的4-羟基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)是由酵母菌磷酸戊糖途径代谢获得;酚类物质主要来源于小麦麸皮,经曲霉和特定酵母菌代谢后形成酚类物质。与韩式酱油相比,本文中由AY型和T型鲁氏酵母菌发酵的酱油样品中含有更高含量的酯类、醇类等物质,并且本次的酱油样品较之韩式酱油中含有更多种类的香气物质[32]。研究结果还显示,本次研究的两种酵母菌产生物质的种类及含量优于日本Shiro Shoyu的香气物质[33]。可以看出本文中的两种鲁氏酵母菌在各自的代谢途径下,能够积累更多的香气物质,表明其在生成香气物质方面,具有一定优势。

2.2 OAV结合PCA分析

OAV(气味活度值)计算方法为气味化合物的浓度与该物质的嗅闻阈值的比值,广泛用于食品中关键风味化合物的鉴定。一般认定,当化合物的OAV>1则对食品气味有一定贡献,且OAV越大,其贡献越大[35]。由表4可知,通过对酱油样品中OAV的计算,发现AY酵母菌酿造酱油中的4-羟基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)、2/3-甲基丁醛及苯乙醛的OAV高于其他样品的OAV值,T型鲁氏酵母菌的1-辛烯-3-醇及3-甲硫基丙醛的OAV值高于其他样品的OAV值。

表4 三种样品中OAV>1化合物统计表Table 4 Statistical tables for OAV>1 compounds in three samples

由图3可知,前两个主成分的累计方差达到了84.379%,满足主成分分析条件,三个样品分布在坐标的三个象限,说明因为不同酵母菌的加入,样品中各香气物质成分的组成和含量上有所区别,以三种样品的坐标显示,AY型鲁氏酵母菌发酵酱油的香气优势明显强于T型鲁氏酵母菌发酵酱油。结合香气成分的PCA分析,T型鲁氏酵母菌发酵酱油以熟土豆气味为主,并伴有蘑菇香气;AY型鲁氏酵母菌发酵酱油以甜香香气为主,并伴有麦芽香气;空白组样品中则伴有可可粉和烟熏香气。

图3 三种酱油样品及香气物质PCA分析图Fig.3 PCA analysis of three kinds of soy sauce and aroma

结合表3与表4的结果可知,尽管OAV值的计算可以明确酱油中香气物质的贡献度,但是,在结合嗅闻结果发现,部分香气物质尽管没能检测到其含量,但依然可以嗅闻到相应香气特点,如3-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、糠醇、苯乙醇、2,5-二甲基吡嗪以及4-乙基愈创木酚等。因此,OVA值结合嗅闻结果更能体现香气物质在酱油香气上的贡献度。

2.3 感官评价结果

由图4可以看出,T样品的整体香气中,以酸味和熟土豆香气较为突出;AY样品的酒精香味及烤肉香气等较为突出;空白(空白)组与其他两组相比,在香气感官评分方面较差,也间接说明酵母菌对酱油香气的形成具有极大的贡献作用。此外,结合图3和图4可以看出,香气的感官评价结果与PCA分析的OAV>1的结果基本相符。图5的滋味感官结果表明,T样品中的咸味、酸味及后味都要强于其他两组样品,但AY样品鲜味和甜味口感则更加优越,而空白样品在滋味感官上并不具有明显特点。此外,根据感官结果显示,AY样品在香气方面更加饱满,滋味方面更加圆润。

图4 三种酱油香气感官雷达图Fig.4 Sensor radar diagram of three kinds of soy sauce aroma

图5 三种酱油滋味感官雷达图Fig.5 Sensory radar diagram of three kinds of soy sauce

3 结论

酱油在日常生活中有着不可替代的作用,也使得越来越多的研究集中在改善其品质上。因为酱油的发酵受到原料、微生物种类、微生物代谢、发酵条件以及加热杀菌等因素的影响,所以成品酱油中挥发性香气物质的组成和含量也会因此受到影响。本次实验结果显示,AY型鲁氏酵母菌能够代谢出更多种类的酯类、醇类及吡嗪类化合物,并且在产HEMF、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、4-乙基愈创木酚等关键香气化合物方面具有优势,其整体香气呈甜香及麦芽香;T型鲁氏酵母菌能够产出更高含量的乙醇、酯类及酚类化合物,其整体香气呈熟土豆香气。感官结果显示,由AY型鲁氏酵母菌发酵酱油整体香气更加饱满,口感圆润;由T型鲁氏酵母菌发酵酱油整体香气中酸味较为突出,有掩盖其他香气的趋势。因此研究结果显示,AY型鲁氏酵母菌的整体产香效果优于T型鲁氏酵母菌的产香效果。因为酱油的发酵过程属于多菌种代谢过程,因此,将进一步研究AY型鲁氏酵母菌和T型鲁氏酵母菌共同作用下,对酱油中挥发性香气物质的影响,以便进一步分析两种酱油酵母菌对酱油中挥发性香气物质的影响,从而为酱油发酵提供指导理论。