近红外光谱法快速测定藜麦籽粒粗蛋白含量

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(1.攀枝花学院生物与化学工程学院,四川攀枝花 617000;2.四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川成都 610061;3.四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都 610066)

藜麦(Chenopodimquinoawilld.)又称藜米、南美藜、昆诺阿藜等,为苋科(Amaranthaceae)藜亚科(Chenopodiaceae)藜属(Chenopodium)一年生双子叶植物,是一种原产南美洲的杂粮假谷类作物,近年来发展非常迅速[1-6]。联合国粮农组织将藜麦视为可满足人体基本营养需求的单体粮食作物,并将2013年设为国际藜麦年。美国航天局则将藜麦列为外太空空间的理想“太空粮食”[7]。藜麦的营养物质含量丰富,成分均衡,其蛋白质含量为12%～23% 左右,富含有人体必需的八种氨基酸且与世界卫生组织发布的人体必需氨基酸摄入量高度吻合,同时藜麦蛋白质的净消化率、净利用率显著高于其他谷物,是人类优秀的蛋白质来源[8-12]。藜麦籽粒蛋白质含量是评价藜麦品质的主要指标之一,在食品加工、商品定级、品种选育等方面具有重要的参考价值,因此实现藜麦蛋白质含量快速检测具有重要意义。目前测量谷物蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法,双缩脲法,紫外吸收法等,这些方法步骤繁多,对操作人员要求较高,不利于对大量样品进行快速检测。

近红外技术的研究与应用已成为近年来国内外发展最快的光谱分析技术,具有简单、快速、无损、环保、分析成本低、重现性好、便于实现在线检测的特点,已经成为现代无损检测的代表和主要发展方向[13]。从20世纪60年代以来,近红外技术开始用于谷物品质测定,目前已用于各种谷物籽粒分析包括小麦、玉米、大豆、燕麦、花生等多个作物,主要测试指标包括水分、蛋白质、脂肪、纤维、容重等[14]。王姣姣等[15]以190份豌豆为原料,建立了豌豆蛋白质、淀粉、脂肪和总多酚的快速检测模型。王丽君等[16]利用傅里叶变换近红外光谱技术扫描绿豆籽粒和粉末样品,预测了绿豆籽粒及粉末中蛋白、淀粉和直链淀粉3种组分的含量,并将其运用到绿豆品质评价工作中。但关于藜麦粗蛋白含量的近红外分析研究报道较少,曹晓宁等[17-19]建立了基于近红外光谱技术的藜麦脂肪、纤维和淀粉的预测模型;石振兴等[20-21]对藜麦粉的粗蛋白、粗脂肪和淀粉含量进行了近红外研究,构建了近红外预测模型,但二者均未对藜麦籽粒粗蛋白含量进行近红外建模研究。2014年,Escuredo等[22]则通过近红外光谱分析技术得到了藜麦中12种氨基酸快速测定的近红外模型,预测效果较好。

本研究利用近红外光谱分析技术对藜麦籽粒粗蛋白含量进行快速检测研究,试图建立稳定性好、精确度高的藜麦籽粒粗蛋白含量近红外分析模型,为高蛋白藜麦品种选育和栽培措施研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藜麦种子(122份) 2018年10月收获并自然风干的净籽粒,来自于攀枝花市格萨拉乡、阿坝州马尔康市、西藏自治区日喀则市;浓硫酸、氢氧化钠、硼酸、盐酸、硫酸亚铁铵 分析纯,成都市科龙化工试剂厂;溴甲酚绿、甲基红 分析纯,美国Sigma公司;凯氏定氮高效催化剂片 无纯度分级,赛诺利康生物技术(北京)有限公司。

Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 丹麦福斯(FOSS)分析仪器公司;DT208消化炉 丹麦福斯(FOSS)分析仪器公司;ME104E电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DA7200二极管阵列近红外光谱仪 瑞典波通(Perten)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 预处理方法 将122份样本根据浓度范围和分布均匀的原则,将其中的94份作为建模集,其余28份样本作为验证集。每个建模集样本分为一式两份,一份磨碎后过100目筛,用于粗蛋白含量化学值的测定;另一份完整籽粒用于近红外光谱采集。每个验证集样本也分为一式两份,一份磨碎后过100目筛,用于粗蛋白含量化学值的测定;另一份完整籽粒用模型预测蛋白含量进行外部验证。

1.2.2 国标法测定藜麦籽粒粗蛋白含量 依据国标GB/T 5511-2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算凯氏法》进行藜麦籽粒粗蛋白含量的测定,蛋白转换系数6.25。每个藜麦样品做3次重复。

1.2.3 红外光谱采集 将藜麦籽粒样品均匀装入φ75 mm的样品盘中,再用直尺刮平藜麦表面和盘口齐平。使用近红外分析仪以5 nm的分辨率扫描60次,样品及环境温度均为26 ℃,光谱扫描范围为950～1650 nm,得扫描光谱图。每个样品重复扫描2次,每次扫描均重新装样,获得平均光谱曲线。

1.3 数据处理

参考杨勇等[23]的方法,用Unscrambler10.4软件对得到的藜麦籽粒光谱进行预处理并使用偏最小二乘法(PLS)建立模型。模型的预测效果根据校正决定系数(R2)、校正均方根误差(RMSEC)、交叉验证决定系数(R2)和预测均方根误差(RMSEP)进行综合评测,以得到最优的近红外模型组合。

表1 建模集和验证集籽粒粗蛋白含量Table 1 Kernel crude protein content of quinoa samples used for calibration and validation

2 结果与分析

2.1 藜麦籽粒粗蛋白测试结果统计

由建模集和预测集藜麦样品籽粒粗蛋白的分布情况(表1)可知,122份样品中,建模集的94个样品中,粗蛋白含量变异范围为11.3%～22.7%,平均含量为14.9%,验证集的28个样品中,粗蛋白含量变异范围为10.2%～20.9%,平均含量为15.3%。与前人研究结果相比,分布范围更广[21,24],分布较为均匀,具有较好的代表性。

表2 各种光谱预处理方法所得模型的评价参数Table 2 Evaluation parameters of models obtained by various spectral pretreatment methods

2.2 藜麦籽粒的近红外光谱

每份藜麦粉末扫描3次,采用Unscrambler 10.4软件的主成份分析(PCA,principal component analysis)法和光谱图去除了化学异常值样本1份和光谱异常值样本4份。如图1所示,参试样品在波长950～1650 nm范围内均有明显的吸收峰,其中不同样本在950～1130 nm区间的近红外光谱较分散,而在1130～1650 nm区间则十分接近。有文献报道[25-27],950～1250 nm处于C-H等键的多级倍频区,光谱图较散;而1250～1650 nm区间,则是C-H键、O-H键和C-O键的一级倍频和组合频区,信号强,能反映出样品的性质和关联;和蛋白质相关的N-H键吸收峰位于1034和1500 nm。所有样品的图谱变化趋势基本相似,不同藜麦中的营养成分含量的高低差异,使得每份样品在同一吸收峰的吸光度略有不同,可以通过建立数学模型来反映近红外光谱和成分含量之间的关系。

图1 去除异常光谱值后的藜麦籽粒原始光谱图Fig.1 The original spectra of quinoa except anomalous spectral

2.3 光谱模型的建立

比较了9种光谱预处理方法(表2),结果表明SG(Savitzky-Golay,滤波拟合法)+SNV(Standard Normal Variate,标准正态变量)的校正和交叉验证决定系数最高,校正和预测均方根误差最低,说明该方法所建的模型为最佳。

粗蛋白含量模型交叉检验得到预测值和实际值的散点图,校正集决定系数(R2)为0.9380,被测组分浓度分析误差(RMSEP)为0.4823,说明预测值和真实值差距较小,模型效果较好(图2)。石振兴等[20]利用藜麦粉末建立了藜麦蛋白含量的近红外检测模型,其决定系数和分析误差分别为0.9191和0.598,略差于本研究结果,且本研究以籽粒为检测对象,比前者的粉末更加便利。

图2 藜麦籽粒蛋白含量校正模型(A)和交叉验证模型(B)Fig.2 A:Corrected model for quinoa grain protein content;B:The cross-validated model for quinoa grain protein content

2.4 外部检验

为了进一步验证藜麦近红外模型的准确性,用28份样品进行外部检验。在DA7200近红外光谱仪上扫描并通过模型计算被测样品的籽粒粗蛋白含量预测值,然后用DPS7.05软件对预测值和国标法测定值进行比较,结果如图3所示。28份藜麦样品的籽粒粗蛋白含量国标法测定值和模型预测值之间具有极显著的相关性(R2=0.9416)。经单因素方差分析表明,国标法测定值和模型预测值之间无显著差异(P=0.7095),说明模型可靠性较好。

图3 藜麦籽粒粗蛋白模型的外部检验结果Fig.3 External verification results of quinoakernel crude protein content using PLS model

3 结论

在950～1650 nm波长的近红外范围中,采用SG+SNV进行光谱预处理后,利用PLS建立藜麦籽粒近红外光谱粗蛋白测定模型,模型决定系数值为0.9380,均方误差为0.4823。经验证,该模型可靠性较好,能够较准确的预测藜麦籽粒的粗蛋白含量,为优质藜麦品种的选育提供技术支撑。