低温预处理对百子莲体细胞胚胎诱导的影响及生理机制研究

岳建华，张梦帅，董 艳，张 燕，张 华，张 琰

(1.信阳农林学院 园艺学院，河南 信阳 464100； 2.信阳市大别山区园艺植物遗传改良重点实验室，河南 信阳 464100; 3.信阳农林学院 林学院，河南 信阳 464100)

百子莲(Agapanthuspraecoxssp.orientalis)为多年生单子叶草本花卉，原产非洲南部，花姿优美，抗性极强，可做切花、盆栽、花坛、花境及地被应用，并有“爱情花”的美誉，具有较大的推广前景[1]。百子莲引入我国后，其花芽分化[2-3]、株型调控[4-5]、抗性基因[6]已有较系统的研究。因其引种后不易结实[2-3]，目前繁殖方式以分株为主，但增殖系数低，而其花前成熟期偏长，约3～4 a，限制了这一优良种质资源的推广[7]。

植物组织培养，尤其是体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis，SE)成为百子莲快繁的重要途径。自SUZUKI等[8]初步建立百子莲SE再生体系之后，国内研究者进行了后续技术研发，但由于植物体胚发生机制仍是未解之谜[9]，目前效率依然偏低，百子莲SE途径仍未实现产业化应用。

植物SE最早从细胞全能性(Cell totipotency)理论中衍生出来[9]，来源于非合子细胞，自胡萝卜(Daucuscarota)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)等双子叶植物成功进行SE诱导后，目前唐菖蒲(Gladiolushybridus)、红姜花(Hedychiumcoccineum)和朱顶红(Hippeastrumhybridum)等单子叶观赏植物均已成功诱导出体细胞胚，但普遍存在成胚效率偏低的问题[10-12]。

高效体胚诱导体系的优化研究主要集中在培养基组分如植物生长调节剂、碳源的改良等方面。激素信号平衡显著影响植物体胚发生效果[13]，植物离体细胞、组织对激素类别、用量的响应较为特异[14]。糖源通过提供能量，调节细胞渗透压影响体胚发生，但不同植物对碳源种类、用量的需求不尽相同[9,13]，例如多数植物最佳碳源为蔗糖，而麦芽糖利于欧洲云杉(PiceaabiesL.Karst)成熟胚诱导[15]。因此，系统地进行植物SE体系培养基组分的优化是一项繁琐的工作，此外，不同基因型、材料状态、发育程度对培养基的要求又具有特异性[13,16]。目前有研究报道低温预处理可有效提升离体培养效果，操作简便，效果明显[16-17]，对一些植物离体培养具有促进效果，例如黑麦(SecalecerealeL.)[16]、展松(Pinuspatula)[18]、宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)[19]等。但相关研究针对体胚诱导关键期的报道较少，其生理机制的研究更是鲜见报道。

百子莲SE技术体系有较大的提升空间，目前关于低温预处理及其生理机制的研究未见报道。鉴于此，以胚性愈伤组织(Embryogenic callus，EC)为试材，采用低温预处理方式优化体胚发生体系；同时，通过内源激素、糖代谢、氧化胁迫等体胚发生相关生理指标的测定，初步揭示低温预处理对百子莲体胚发生的生理调节机制，为百子莲SE体系的改良提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

百子莲种苗购自南京市彩虹花卉公司，栽植于信阳农林学院校内实验基地。2017年5—6月份，选取5年生植株即将开裂的小花苞，切取小花梗作为外植体进行愈伤组织诱导。愈伤组织每月继代1次，7～9个月后，得到单细胞起源的EC，继代6个月后用于试验研究。选取的EC状态一致，生长旺盛，颜色鲜黄，结构疏松。

1.2 试验方法

将EC接种到体胚诱导培养基(MS+3%蔗糖+0.7%琼脂)上，pH值5.8，121 ℃高压灭菌25 min，60 ℃左右于超净工作台内分装至90 mm×16 mm玻璃培养皿，每培养皿25 mL，冷却至室温后接种，每培养皿接种1.0 g试验材料，平均分为7份。每处理含5培养皿材料，设3次重复。在4 ℃低温下预处理0、2、4、6 d，黑暗培养7 d后转至光下培养。

1.3 培养条件

培养室温度(25±2)℃，相对湿度65%，光照强度为50 μmol/(m2·s)。

1.4 观察及计数

培养30 d后，以形态完整，尺寸大于1 mm的不透明状体胚计数，统计每团EC产生的体胚数量。

1.5 生理指标测定

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定糖类、激素、活性氧含量与保护酶活性等生理指标[20]，委托上海酶联生物科技有限公司测定。方法如下：称取1.0 g鲜样，加2 mL样品提取液，冰浴匀浆，转入10 mL试管；4 ℃提取上清，过C-18固相萃取柱；转入5 mL离心管，真空冷冻干燥，用样品稀释液定容；加标样及待测样，取标样稀释为梯度浓度(含0 ng/mL)，标样及待测样加入96孔酶标板，每孔50 μL，样品设3次生物学重复；加一抗，将酶标板置入37 ℃湿盒内，30 min后洗板，洗涤4次。加二抗，放入湿盒内，置于37 ℃ 30 min。洗板后加底物显色，每孔加50 μL 2 mol/L硫酸终止反应；在酶标仪上依次测定标准物梯度浓度和各样品490 nm处的OD值，根据标准曲线计算样品含量或酶活性。

1.6 数据分析

用Excel 2016、GraphPad Prism 5、Adobe Acrobat Pro DC、Adobe Photoshop进行数据整理和作图，用IBM SPSS Statistics 20进行显著性检验(Duncan法，P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 低温预处理时间对百子莲体胚诱导数量的影响

如图1所示，低温预处理时间对体胚诱导数量有显著影响。不作低温预处理情况下，每团细胞产生体胚数量为11.19个，低温预处理2、4、6 d后，体胚数量分别为18.33、9.24、2.71个，其中低温预处理2 d对体胚诱导有促进作用，体胚数量比对照显著增加63.81%(P<0.05)；低温处理4 d时，体胚数量降低17.43%；处理6 d后，体胚数量显著下降75.78%(P<0.05)。以上结果表明，低温预处理可以显著影响体胚诱导效果，处理2 d对百子莲体胚发生具有促进作用，处理4 d以上对体胚诱导不利。

A.低温预处理时间影响体胚诱导的形态分析；B.低温预处理时间影响体胚诱导数量的差异分析；标尺为1 cm，n=3,不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同A.Morphological analysis of somatic embryo induction regulated by cold pre-treatment time;B.Difference analysis of somatic embryo induction number regulated by cold pre-treatment time;bar=1 cm,n=3,different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05),the same below图1 低温预处理时间对百子莲体胚诱导数量的影响Fig.1 Effects of cold pre-treatment time on somatic embryo induction number in A.praecox

2.2 低温预处理时间对百子莲内源激素代谢的影响

图2结果表明，低温预处理对百子莲体胚诱导期内源激素含量有不同影响。生长素类(图2A、2B、2C)、赤霉素(GA)类(图2D、2E、2F、2G)含量与体胚数量具有相似的变化规律，IAA、结合态IAA、GA含量均为单峰曲线变化，趋势与体胚数量变化规律一致，其中低温预处理2 d的GA1、GA3含量及IAA氧化酶活性显著高于对照(P<0.05)。由图2H可知，经低温预处理后细胞分裂素(CTK)含量逐渐降低，且均低于对照，表明低温预处理时间对CTK含量的影响较大，且具有梯度效应；油菜素内酯(BR)含量变化幅度较小，各处理差异不显著，整体变化趋势与体胚数量变化规律相反(图2I)；低温处理2 d体胚组织内ABA含量较低，而处理4、6 d，ABA含量相对较高，与体胚数量的规律相反(图2J)。乙烯、茉莉酸(JA)含量呈波动变化，其中低温处理2、6 d后，乙烯含量比对照显著增加，JA含量则显著降低(图2K、2L，P<0.05)。综上，生长素、GA及CTK含量受低温预处理的调节较明显，其中CTK的变化具有梯度效应。

图2 不同低温预处理时间对百子莲体胚诱导期内源激素含量的影响Fig.2 Effects of cold pre-treatment time on endogenous hormone contents in somatic embryo induction stage

2.3 低温预处理时间对百子莲糖代谢的影响

糖代谢显著受到低温预处理的调节(图3)。由图3A可知，低温预处理2、4、6 d，总糖含量比对照分别显著增加31.44%、23.88%、28.75%(P<0.05)；淀粉含量和体胚数量趋势一致，并随处理时间呈梯度变化，其中处理2、4 d，含量比对照分别显著增加51.91%、26.41%(P<0.05)(图3B)；蔗糖含量的变化也呈现梯度效应，但与体胚数量变化趋势相反，其中处理2 d，体胚组织内蔗糖含量显著降低29.18%(P<0.05)(图3C)；图3E所示，处理2 d，麦芽糖含量显著增加36.50%(P<0.05)；由图3D、3F可知，体胚组织内葡萄糖和果糖含量受低温预处理的影响相对较小。综上，总糖、淀粉、蔗糖及麦芽糖含量显著受到低温预处理时间的影响，其中淀粉、麦芽糖含量和体胚诱导数量的一致性较强。

2.4 低温预处理时间对百子莲氧化胁迫的影响

低温预处理时间对活性氧及保护酶活性具有显著影响(图4)。活性氧(ROS)活性随低温预处理时间的增加而逐渐降低，且具有梯度变化(图4A)；·OH含量在低温预处理2 d的处理中达到较高水平(图4B)；H2O2含量和过氧化物酶(POD)活性变化趋势相同，且均具有梯度效应，低温预处理2 d使H2O2含量比对照显著减少25.35%，POD活性比对照显著降低18.41%(图4C、4D，P<0.05)；低温预处理后，过氧化氢酶(CAT)活性略有增强，呈单峰曲线变化，其中处理4 d的CAT活性最高(图4E)；超氧化物歧化酶(SOD)活性呈波动变化，处理2 d比对照显著增加17.08%，而处理4 d比对照显著降低30.70%(P<0.05)，处理6 d的处理又有所升高(图4F)。综上，低温预处理可显著改变氧化胁迫的平衡，对体胚诱导产生影响，其中H2O2含量和POD活性随处理时间的变化具有梯度效应，受到低温处理的调节较显著。

图3 不同低温预处理时间对百子莲体胚诱导期糖代谢的影响Fig.3 Effects of different cold pre-treatment time on sugar metabolism in somatic embryo induction stage

图4 不同低温预处理时间对百子莲体胚诱导期活性氧积累及保护酶活性的影响Fig.4 Effects of different cold pre-treatment time on ROS accumulation and protective enzyme activity in somatic embryo induction stage

2.5 低温预处理下百子莲各指标的相关性分析

为分析低温预处理对百子莲体胚发生效果的影响，并揭示相关生理调节机制，将体胚诱导数量、生理指标进行相关性分析(表1)。仅显示生理指标与体胚诱导数量相关性较强(Pearson相关系数>0.700)的相关系数。

相关性分析结果表明，低温预处理影响下，体胚诱导数量与生理指标达到较高的相关水平(表1)。IAA、CTK含量与体胚数量的相关系数分别达到了0.880、0.705的较高水平。淀粉、蔗糖、麦芽糖与体胚数量的相关系数分别为0.786、-0.970、0.742，表明淀粉、麦芽糖等糖源利于体胚数量增加，而内源蔗糖含量过高对体胚诱导不利。·OH含量与体胚数量的相关系数为0.745，H2O2含量、POD活性与体胚数量的相关系数分别为-0.886和-0.993，其中POD活性与体胚数量呈极显著负相关(P<0.01)。各生理指标之间也存在一定的相关性，可能产生相互影响。相关性分析表明，IAA、CTK、淀粉、麦芽糖含量提高可能促进体胚数量，而较高的蔗糖含量、H2O2含量、POD活性对成胚不利。

表1 百子莲体胚诱导阶段体胚数量与生理指标的相关性分析Tab.1 Correlation analysis between somatic embryo number and physiological index in somatic embryo induction stage

3 结论与讨论

低温预处理可以改变细胞壁与原生质体间的物质交换程度，通过影响基因表达改变细胞分裂及分化进程，可有效提高体胚诱导数量[18]。随处理时间增加，低温预处理对离体培养的作用通常由促进转变为抑制，例如小麦(TriticumaestivumL.)[17]、宁夏枸杞[19]等，本研究中4 ℃处理2 d可显著促进体胚诱导。本研究结果同时表明，低温预处理可通过调节激素代谢、糖代谢、氧化胁迫强度影响百子莲体胚诱导数量。

3.1 低温预处理可通过调节激素代谢影响体胚发生

低温预处理可以影响细胞内源激素的变化，而激素间的平衡对植物发育至关重要[13-14,21-22]。张菊平等[23]发现低温预处理可以影响IAA、ABA含量，使辣椒(Capsicumannuum)配子体发育途径转为孢子体途径。短期低温处理使蝴蝶兰(Phalaenopsisspp.)叶片、小麦花药内源IAA、GA含量增加，而ABA含量随低温胁迫强度增加而增加[22,24]，以上报道与本研究IAA、GA和ABA含量结果基本一致。LIU等[13]转录组数据表明，IAA和ABA信号在楸(Catalpabungei)SE体系中具有关键作用。内源激素对体细胞胚极性的建立和发育至关重要，尤其是内源IAA的富集利于体胚发生[13,25]；本研究中，IAA含量小幅变化，趋势与体胚数量基本一致。在体胚发生过程中，蛋白质的合成加强，CTK可在翻译水平上刺激蛋白质合成[26]，并诱导IAA的生物合成[27]，本研究中IAA和CTK含量的相关系数为0.749，表明CTK和IAA在体胚发育过程中可能起着协同促进作用，而CTK含量的梯度变化规律及其对体胚数量的调节机制有待进一步分析。ABA可以降低DNA甲基化水平，促进体胚发生的同步化[28]，从而促进体胚数量的增加，但过量会导致胚胎败育。以上结果为针对性调节培养基激素配比，从而促进离体培养内源激素信号的再平衡提供了启示和参考[24]。

3.2 低温预处理可通过调节糖代谢影响体胚发生

碳水化合物是影响体细胞胚胎发生的关键调节因素，不仅为细胞提供能量，也对渗透压有着一定的调节作用[29]。低温可通过影响内源碳水化合物的种类、含量而影响细胞发育进程[22]。王国霞等[30]发现低温处理可以增加油茶(Camelliaoleifera)可溶性糖含量，姜寒玉等[31]发现低温胁迫可以快速提升葡萄(Vitisvinifera)蔗糖含量，与本研究结果基本一致。淀粉的积累通常可作为体胚发生中的重要事件，淀粉在体胚发育过程中快速分解，为细胞分裂提供能量[9]，有研究表明，麦芽糖和淀粉的积累对成胚数量起到促进作用，这些物质的积累在体胚发育转变期至关重要[15]。本研究中，总糖、淀粉、麦芽糖含量均在低温预处理2 d的样品中达到最高水平，为体胚发育提供了充足的能量储备。

3.3 低温预处理可通过调节氧化胁迫平衡影响体胚发生

通常情况下，短暂的低温预处理可以提高抗氧化酶类和抗性蛋白的表达[21,30]。小麦、油茶在经受低温胁迫后，POD、CAT和SOD等抗氧化酶活性上升[21,30]，与本研究结果基本一致。植物细胞在受到低温等胁迫的情况下会增加ROS的产生，如H2O2和·OH[32]，对蛋白质、脂类、碳水化合物和脱氧核糖核酸代谢造成损害，最终导致氧化胁迫[33]。·OH是活性氧最有害的形式，会引起DNA损伤[32]，而H2O2被认为会影响到基因的表达，是非生物胁迫最重要的信号分子之一[34]。植物中的活性氧解毒过程对于保护植物细胞及其细胞器免受影响至关重要。随低温处理时间加长，植物细胞体内H2O2含量增多，细胞自身会做出一些应激反应，比如POD等保护酶活性的增加[35]。本研究发现，适度的低温预处理可通过提升保护酶活性而影响体胚发生效果。

综上，低温预处理可提升百子莲体胚诱导数量，其中4 ℃处理2 d效果较好，比对照显著增加63.81%(P<0.05)，随处理时间增加，体胚诱导效果由好转差。4 ℃处理2 d可促进IAA、GA等激素和淀粉、麦芽糖等糖源的富集，对百子莲体胚诱导具有促进作用；而H2O2含量增加、POD活性的增强，表明氧化胁迫加剧，对体胚诱导不利。