银杏叶黄酮的微波辅助提取及其抑菌作用研究

李敬，尤颖，吕惠丽，穆娟

(河北经贸大学 生物科学与工程学院，石家庄 050061)

银杏(GinkgobilobaL.)被称为植物界的“活化石”，是现今地球上最古老的树种之一[1]。银杏的叶和种仁中含有天然活性物质黄酮及苦内酯等多种成分，具有溶解胆固醇、扩张血管的作用，对改善脑功能障碍、动脉硬化、高血压、眩晕、耳鸣、头痛、老年痴呆、记忆力减退等有明显效果[2,3]，其防病、治病的价值在我国古代就有记载，如《本草纲目》中详解为：“银杏，熟食温肺、益气、定喘嗽、缩小便、止白浊；生食降痰、消毒杀虫”[4]。近年来，对银杏化学成分、药理成分及生产应用的研究十分流行[5-7]。

黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分，常作为抗菌剂、抗氧化剂及感光剂等[8]。银杏叶中的黄酮类物质不仅是一种比较理想的药物，也是一类重要的保健食品功能因子，具有广阔的应用前景，是当今医药和食品工业共同关注的焦点。但目前黄酮的提取率普遍不高，提高银杏叶黄酮化合物的提取率已成为进行黄酮产品开发需要解决的关键问题。同时，开发利用黄酮类化合物的抑菌功效，可以为医药食品工业提供丰富的原料。因此，本文对银杏叶黄酮的微波辅助提取工艺及其抑菌作用进行了研究，对银杏叶黄酮资源的开发和利用提供了数据参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

银杏叶：采自河北经贸大学校园；芦丁标准品：中国药业生物制品检定所；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、无水乙酸钠、葡萄糖、蔗糖：均为分析纯；琼脂粉、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨：均为生化试剂。

1.2 试验仪器

微波炉 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；722可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；SHD-III型循环水式多用真空泵 保定高新区阳光科教仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 银杏叶黄酮提取工艺流程

原料(银杏叶)→烘干→粉碎→过筛→称量→浸提→微波处理→抽滤→脱色→浓缩→黄酮类化合物粗提物。

1.3.2 银杏叶总黄酮得率的计算

式中：c为黄酮类化合物的浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；N为稀释倍数；m为银杏叶干粉的质量，g[9]。

1.3.3 银杏叶黄酮抑菌效力的测定

采用滤纸片扩散法测定抑菌圈[10]。

1.3.3.1 滤纸片的制备及处理

将滤纸剪成直径为8 mm大小的圆片，置于试管中，塞上棉塞，高压蒸汽灭菌后，放到银杏叶提取液中浸泡，取出，沥去多余药液，直接贴入刚接种供试菌株的培养基上，以浸泡过无菌生理盐水的滤纸片作对照。

1.3.3.2 接种培养

准确吸取已经配制好的菌悬液(大肠杆菌及金黄色葡萄球菌)0.1 mL加入已倒好的平板培养基中，涂布均匀，贴入处理好的滤纸片，每种菌2组培养基。将培养基置于恒温培养箱中，大肠杆菌于37 ℃培养1～2 d，金黄色葡萄球菌于28 ℃培养2～3 d，待菌长出后观察是否有抑菌圈。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对银杏叶总黄酮得率的影响

准确称取5份银杏叶粉末，每份1.000 g，置于锥形瓶中，按照1∶20 (g/mL)的料液比分别加入浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在480 W微波功率下处理15 s，计算银杏叶总黄酮的得率，以黄酮得率为考察指标。

由图1可知，在固定料液比1∶20、辐射时间15 s、微波功率480 W条件下，随着乙醇浓度的增加，黄酮得率增大。当乙醇浓度达到80%时，黄酮类化合物的溶解度最大，得率也最高；而后，当乙醇浓度再增加时，黄酮类化合物的溶解度降低，不利于提取，黄酮得率下降。可能是因为随着乙醇浓度的增大，溶剂的极性随之降低，使得提取环境不利于有极性的黄酮类化合物的溶出，从而造成提取率下降。

图1 乙醇浓度对银杏叶总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.2 料液比对银杏叶总黄酮得率的影响

准确称取5份银杏叶粉末，每份1.000 g，置于锥形瓶中，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入浓度为80%的乙醇，在480 W微波功率下提取15 s，计算银杏叶总黄酮的得率。

由图2可知，在固定乙醇浓度80%、辐射时间15 s、微波功率480 W条件下，黄酮得率随料液比从1∶10到1∶25逐渐增大，而从1∶25到1∶30逐渐下降。可能是在一定范围内溶剂用量的增加有助于银杏叶黄酮类化合物的浸出。溶剂用量太少，提取不太完全；但溶剂用量太大，微波加热的负荷增大，达到提取完全所需要的时间也相应增加，结果在限定时间(15 s)内银杏叶总黄酮得率反而下降。

图2 料液比对银杏叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of the ratio of solid to liquid on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.3 提取时间对银杏叶总黄酮得率的影响

按照料液比1∶20 (g/mL)加入浓度为80%的乙醇，用480 W微波功率分别提取6，9，12，15，18 s。计算银杏叶总黄酮的得率，记录试验结果。

由图3可知，在固定料液比1∶20、乙醇浓度80%、微波功率480 W条件下，银杏叶总黄酮得率与辐射时间并不呈现简单的正比关系，15 s内黄酮得率随辐射时间延长呈上升趋势，15 s以后开始下降，15 s时的得率最高，提取效果最好。原因可能是时间过短，黄酮提取不完全；时间过长，微波的强热效应又开始对黄酮产生分解作用，导致黄酮得率下降。

图3 辐射时间对银杏叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of radiation time on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.4 微波功率对银杏叶总黄酮得率的影响

按照料液比1∶20 (g/mL)加入浓度为80%的乙醇，在此条件下，分别用160，320，480，640，800 W微波功率处理15 s，计算银杏叶总黄酮的得率。

由图4可知，在固定料液比1∶20、乙醇浓度80%、辐射时间15 s条件下，随着微波功率的升高，黄酮类化合物的得率增加；当微波处理功率达到640 W时，总黄酮得率达到最大值；此时，如果继续增大微波功率，总黄酮得率反而下降。原因可能是当功率足够高时，细胞内温度迅速升高，高温使细胞内部压力超过细胞空间膨胀的能力，导致细胞破裂，同时也使得细胞内黄酮类化合物的分子结构遭到破坏，活性降低，从而造成总黄酮得率降低。

图4 微波功率对银杏叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.5 银杏叶总黄酮提取的正交试验

影响微波法提取银杏叶黄酮类化合物的因素主要是乙醇浓度、料液比、辐射时间、微波功率等，采用正交试验法确定微波提取银杏叶黄酮类化合物的最佳条件。

表1 正交试验验因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2可知，这4个因素的影响大小次序为：A(乙醇浓度)>B(料液比)>C(辐射时间)>D(微波功率)。综合考虑，得出的最佳提取工艺为A2B2C1D1，即乙醇浓度为80%、料液比为1∶20、辐射时间为15 s、微波功率640 W。

表2 微波法提取银杏叶黄酮的正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method

续 表

2.6 验证试验

通过正交试验结果，基本上确定了微波法提取银杏叶中黄酮类化合物的最佳工艺条件，下面准确称量3份银杏叶粉末，每份1.000 g，在最佳工艺条件(乙醇浓度为80%、料液比为1∶20、辐射时间为15 s、微波功率640 W)下进行3次验证试验，计算银杏叶总黄酮的得率，以黄酮得率为考察指标，以确定其可行性。

由表3可知，微波法提取银杏叶中黄酮类化合物的最佳工艺条件重复性好，且黄酮得率高于正交表中的最大黄酮得率，因此确定微波法提取银杏叶中黄酮类化合物的最佳提取条件为：乙醇浓度为80%、料液比为1∶20、辐射时间为15 s、微波功率640 W。在此条件下银杏叶总黄酮得率为6.82%。

表3 最佳条件下微波法提取银杏叶黄酮的验证试验结果Table 3 Verification experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method under the optimal conditions

2.7 银杏叶黄酮抑菌效力测定

由表4和图5可知，用微波辅助法提取的银杏叶黄酮类化合物具有抗菌活性，但对每种菌的抑制程度有所不同，其中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出较好的抑制效果，这可能是因为银杏叶黄酮对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的细胞膜造成了损伤，导致大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的活性受到抑制。

表4 银杏叶黄酮对各菌种的抑菌效力Table 4 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

图5 银杏叶黄酮对各菌种的抑菌效力 Fig.5 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

3 结论

本试验在单因素试验的基础上，用正交试验对银杏叶总黄酮的提取工艺参数进行优化。结果表明，微波法提取银杏叶总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度为80%，料液比为1∶20，辐射时间为15 s，微波功率为640 W。在此工艺条件下银杏叶总黄酮的得率可达6.82%。银杏叶黄酮的抑菌试验表明，用微波法提取的银杏叶黄酮对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有较好的抑菌作用。因此可知用该法提取的黄酮类化合物分子结构没有遭到破坏，具有抑菌活性。

本试验采用微波法提取银杏叶总黄酮，不仅可以克服传统提取方法耗时、费用高和得率低等缺点，而且操作简单，溶剂损耗少，副产物少，提取过程中银杏叶细粉不凝集、不糊化，有利于银杏叶黄酮类化合物的大规模工业化生产。