南瓜果实黄酮提取工艺条件优化及其抗氧化性研究

李娜，燕平梅，乔宏萍，张志军，李晓君，贺东亮

(1.太原师范学院，山西 晋中 030619；2.中北大学，太原 030051；3.太原工业学院，太原 030008)

随着现代社会经济的快速发展，人们不仅局限于温饱问题，更注重食品的绿色健康。南瓜又名金瓜、番瓜、饭瓜等，属葫芦科一年生草本蔓性植物[1]，富含β-胡萝卜素、酚类、氨基酸、维生素、植物甾醇、微量元素以及生物黄酮等有效成分[2]。南瓜果实作为药食两用植物有着悠久的历史，在食品及调味品领域有着广泛的应用。

黄酮类物质广泛存在于植物次级代谢产物中，易溶于水、乙醇、甲醇等溶剂中[3]，黄酮类化合物对维持血管正常渗透压[4]、预防冠心病及心绞痛[5,6]、改善心血管功能、延缓衰老等均具有良好疗效[7,8]，黄酮还有抗辐射、消除自由基、防衰老等多种药理作用[9,10]，因此，作为天然食品添加剂、抗氧化剂、食用色素、食用调味品等[11-13]，在食品、调味品以及医药行业中应用尤为广泛，对黄酮类化合物的研究已经成为全球学术界的研究热点，但对南瓜果实黄酮类物质提取及应用的相关报道较少。因此，本试验选择超声波辅助乙醇浸提法提取南瓜黄酮物质，该方法具有提取率高、提取时间短、不破坏有效成分等优点[14]。本研究旨在通过响应面法优化提取南瓜果实中黄酮物质的最佳工艺参数，同时考察南瓜果实黄酮提取物体外抗氧化活性，为进一步开发和利用南瓜资源提供了理论依据与技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将供试南瓜洗净沥干后切片置于60 ℃电热鼓风干燥箱中干燥72 h，冷却后用密封袋密封后放置于干燥器中待用。

DPPH(分析纯)、ABTS(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；其他有机溶剂：均为国产分析纯。

1.2 试验设计

单因素试验分别考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、超声时间(10，20，30，40，50 min)、乙醇浓度(10%、30%、50%、70%、90%)、超声温度(40，50，60，70，80 ℃)、浸泡时间(0，3，6，9，12 h)、粉粹粒径(60，80，100，120，140目)对黄酮含量的影响。在单因素试验基础上，采用Design-Expert 8.0.6试验设计方案，选择乙醇浓度(X1)、超声时间(X2)、超声温度(X3)为考察变量，以黄酮物质含量(Y)为响应值，其编码水平见表1。

表1 超声波提取南瓜黄酮类化合物响应曲面设计因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface design for ultrasonic extraction of flavonoids from pumpkin

1.3 黄酮含量测定

精确称取一定量南瓜粉末于离心管中，加入相应体积的乙醇溶液在设定条件下浸提后，4000 r/min离心10 min后移取上清液备用。采用铝盐螯合显色法测定南瓜果实黄酮含量[15]。

1.4 抗氧化活性测定

1.4.1 DPPH·清除能力测定

将南瓜果实黄酮提取物稀释至不同浓度，每个浓度的样品取0.3 mL于试管中，加入2.7 mL60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，在室温避光条件下反应30 min，于517 nm处测定吸光度值[16]。以含有0.3 mL甲醇和2.7 mL DPPH溶液为空白样品，以Vc作为阳性对照。所有试验重复3次。根据公式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：I为南瓜果实黄酮提取物对DPPH·的清除率；A0为DPPH空白对照的吸光度值；As为样品与DPPH反应后的吸光度值。

1.4.2 ABTS+·清除能力测定

将过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)和ABTS溶液(7 mmol/L)以等体积混合，并于室温下避光反应12～16 h，每次使用前用80%乙醇稀释为ABTS工作液[17]，使其在734 nm处的吸光度值为0.7。设置一系列浓度的南瓜果实黄酮溶液，各取0.3 mL于试管中，加入2.7 mL稀释过的ABTS工作液，轻轻晃荡，摇匀，室温避光条件下反应30 min，并测定734 nm处的吸光度，以浓度为80%乙醇溶液作为空白对照，以Vc为阳性对照，所有试验重复3次。根据公式(2)计算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：I为南瓜果实黄酮提取物对ABTS+·的清除率；A0为ABTS空白对照的吸光度值；As为样品与ABTS反应后的吸光度值。

1.4.3 清除羟基自由基试验

取不同浓度的南瓜果实黄酮各0.3 mL于试管中，再加入H3PO4缓冲液2.0 mL，番红2.0 mL，EDTA-Na2-Fe2+2.0 mL，最后加入2.0 mL的H2O2溶液，充分摇匀，并在40 ℃的水浴锅中保持30 min，测定520 nm处的吸光度[18]，并使用EDTA-Na2-Fe2+溶液作为空白样品，以Vc作为阳性对照，所有试验重复3次。根据公式(3)计算羟基自由基清除率。

(3)

式中：Y为南瓜果实黄酮提取物对·OH的清除率；A0为不加样品和H2O2，Ar为不加样品，As为加样品和H2O2。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

单因素对南瓜果实黄酮含量的影响分别见图1中A～F。料液比、乙醇浓度、超声时间、超声温度、浸泡时间和粉碎粒径对南瓜果实黄酮含量均呈现先升后降的趋势。综合考虑黄酮含量以及试验成本等因素，确定料液比1∶20、乙醇浓度70%、超声时间30 min、超声温度60 ℃、预浸泡时间6 h和粉碎粒径120目为南瓜黄酮的最佳基本提取条件。

图1 料液比、乙醇浓度、超声时间、超声温度、浸泡时间、粉碎粒径对南瓜果实黄酮类化合物得率的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratios, ethanol concentration, ultrasonic time, ultrasonic temperature, soaking time, crushing particle size on extraction rates of flavonoids from pumpkin fruits

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面模型及显著性检验

将乙醇浓度(X1)、超声时间(X2)、超声温度(X3)作为曲面响应法考察的3个单因素，以黄酮含量(%)为响应值，3因素3水平17个组合的响应曲面法分析试验结果见表2。黄酮含量的变幅为1.28%(16号试验)～3.57%(13号试验)。

表2 试验设计及响应值结果Table 2 Experimental design and response value results

续 表

2.2.2 黄酮含量的响应面分析

黄酮类物质的含量回归模型的方差分析见表3。黄酮含量的二次多项式拟合模型极显著(P<0.0001)，F值为60.54，其失拟项P=0.2292>0.05不显著，因此，在试验范围内，此模型与试验数据的拟合性较好；拟合系数R2值是0.9873。说明该模型能够阐明98.73%响应值的变化。由此可以看出，可以用该模型对超声温度、乙醇浓度、超声时间对黄酮类物质含量的影响进行优化和分析。

运用Design-Expert 8.0.6软件对表2中黄酮含量进行试验数据的响应面回归拟合，得出黄酮含量响应值(Y)和各因素(X1、X2、X3)间二次回归模型Y=+3.41+0.14X1+0.046X2-0.13X3-0.73X1X2-0.70X1X3-0.21X2X3-0.73X12-0.44X22-0.66X32，此方程的方差分析和回归分析见表3。

表3 二次多项式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model

由表3可知，乙醇浓度-超声时间交互项、乙醇浓度-超声温度交互项。乙醇浓度二次项、超声时间二次项、超声温度二次项对黄酮含量呈现出极显著水平；乙醇浓度一次项、超声温度一次项、超声时间-超声温度交互项呈现出显著水平；超声时间一次项不显著。

应用Design-Expert 8.0.6软件，超声时间和超声温度与黄酮含量之间的关系见图2。

图2 超声时间和超声温度交互作用对南瓜果实黄酮类化合物得率影响的响应面及等高线图Fig.2 Three-dimensional response surface and contour plot showing the interactive effect of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of flavonoids from pumpkin fruits

由图2中A可知，当乙醇浓度不变时，黄酮含量随着超声温度和超声时间的升高呈现出先上升后下降的趋势，当超声温度为60 ℃且超声时间为30 min时，黄酮含量达到最大值。由图2 中B可知，等高线图接近椭圆形，说明超声时间和超声温度之间交互作用显著。

乙醇浓度和超声温度与黄酮含量之间的关系见图3。

图3 乙醇浓度和超声温度交互作用对南瓜果实黄酮类化合物得率影响的响应面及等高线图Fig.3 Three-dimensional response surface and contour plot showing the interactive effect of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of flavonoids from pumpkin fruits

由图3中A可知，在固定超声时间不变的情况下，黄酮含量随着超声温度与乙醇浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势。当乙醇浓度为70%且超声温度为60 ℃时，黄酮含量达到最大值。由图3中B可知， 乙醇浓度和超声与温度之间交互作用显著。

超声时间和乙醇浓度与黄酮含量之间的关系见图4。

图4 超声时间和乙醇浓度交互作用对南瓜果实黄酮类化合物得率影响的响应面及等高线图Fig.4 Three-dimensional response surface and contour plot showing the interactive effect of ultrasonic time and ethanol concentration on the yield of flavonoids from pumpkin fruits

由图4中A可知，在超声温度固定不变的情况下，黄酮含量随着超声时间和乙醇浓度的增加而先增加后下降，当超声时间为30 min且乙醇浓度为70%时，黄酮含量达到最大值。由图4中B可知，乙醇浓度和超声时间之间交互作用显著。

2.2.3 南瓜果实黄酮提取最优条件的确定及验证

使用Design-Expert 8.0.6软件得到提取南瓜果实黄酮的最佳方案为：乙醇浓度70%、超声时间30 min、超声温度60 ℃，此条件下南瓜果实黄酮的含量达到3.4%。根据上述条件做验证试验，南瓜果实黄酮的平均含量为3.37%，其误差为0.88%，接近预测值，表明南瓜果实黄酮含量的预测值与实测值之间具有良好的拟合性，充分验证了所建模型的有效性，说明回归方程能较真实地反映各因素对南瓜果实黄酮含量的影响。

2.3 南瓜果实黄酮提取物抗氧化性

2.3.1 DPPH·清除能力

南瓜黄酮和Vc清除DPPH·能力的试验结果见图5。

图5 南瓜果实黄酮(A)和Vc (B)对DPPH·清除能力Fig.5 DPPH· scavenging ability of flavonoids from pumpkin fruits (A) and Vc (B)

结果表明，南瓜果实黄酮提取物(A)对DPPH·具有清除作用，但其清除能力显著低于Vc(B)。DPPH·的清除率在南瓜黄酮提取物浓度为0.01～0.07 mg/mL的范围内随着浓度的增加而增加；当黄酮提取物浓度大于0.07 mg/mL时，DPPH·清除率的增幅较小，呈基本稳定状态；当浓度为0.084 mg/mL时，对DPPH·清除率最高，为88.55%。

2.3.2 ABTS+·清除能力

南瓜黄酮和Vc清除ABTS+·的试验结果见图6。

图6 南瓜黄酮(A)和Vc (B)对ABTS+·清除能力Fig.6 ABTS+ ·scavenging ability of flavonoids from pumpkin fruits (A) and Vc (B)

结果表明，南瓜果实黄酮提取物(A)能够清除ABTS+·，但其清除能力显著低于Vc (B)。ABTS+·的清除能力在南瓜黄酮提取物浓度为0～0.05 mg/mL的范围内表现为上升趋势，当浓度大于0.05 mg/mL后，随着黄酮浓度继续增加，ABTS+·的清除能力保持稳定。当黄酮浓度为0.072 mg/mL时，ABTS+·的清除率最高，为89.34%。

2.3.3 羟自由基清除能力测定

南瓜黄酮和Vc清除·OH的试验结果见图7。

图7 南瓜黄酮(A)和Vc (B)对·OH清除能力Fig.7 ·OH scavenging ability of flavonoids from pumpkin fruits (A) and Vc (B)

结果表明，南瓜果实黄酮提取物(A)与Vc (B)对·OH都有清除作用，并且随着南瓜黄酮浓度的增加，两者都呈上升趋势。当南瓜黄酮浓度为0.2 mg/mL时，清除率高达98.34%，高于相同浓度下Vc对·OH的清除率(98.25%)。

3 结论

在单因素试验基础上，通过响应面法设计优化了提取南瓜果实黄酮的3个关键因素，达到拟合性好的回归模型并对其交互项进行了分析。确定最佳提取条件为：料液比1∶20、乙醇浓度70%、超声时间30 min、超声温度60 ℃、预浸泡时间6 h、粉粹粒径120目。此条件下南瓜果实黄酮提取率可达3.57%。通过抗氧化试验研究，南瓜黄酮提取物对DPPH·、ABTS+·、·OH具有不同程度的清除作用，在设置的浓度范围内，3种自由基的清除率与南瓜黄酮类化合物的浓度之间存在一定的量效应关系，当南瓜果实黄酮提取物浓度分别为0.084，0.072，0.2 mg/mL时，对DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率最大。本研究结果表明，南瓜果实黄酮作为一种天然的抗氧化剂，能够在食品添加剂和调味品行业进行深入开发及应用，本研究结果为南瓜黄酮大规模产业化加工提供了一定理论依据和技术参照。