尿酸对果蝇爬行能力的影响

张睿迪，关宝生,3，王嘉淇,3，尹相林,3，张淑红，孙雪薇,3，罗晋成,3，卢 烨，高 升，白 雪

(1.佳木斯大学公共卫生学院；2.佳木斯大学基础医学院；3.黑龙江省痛风研究重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007)

近年来，高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)已成为严重威胁人类健康的代谢性疾病之一，可诱发多种并发症，如痛风、心血管疾病以及肾脏疾病等[1]。有资料报道，西方发达国家人群HUA患病率呈逐年升高趋势[2-4]，近几年，我国的相关研究也显示，部分地区人群HUA患病率大幅度提升，已经与发达国家基本持平[5-7]。HUA现已成为我国排名第二的代谢性疾病[8]，其主要病因是机体内嘌呤代谢紊乱，进而引起体内尿酸(uric acid,UA)水平升高，并以尿酸盐晶体(monosodium urate crystal,MSU)的形式沉积在关节或脏器内，诱发机体炎症反应的发生[9]，进一步促进HUA转变为痛风。因此，本研究通过构建果蝇HUA模型，探讨UA对果蝇爬行能力的影响，为进一步深入探讨UA的致炎作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 果蝇品系及饲养条件本研究选用W1118野生型黑腹果蝇，由佳木斯大学尿酸生理功能研究团队自有。果蝇均使用标准玉米粉培养基饲养，每天更换培养基。在温度(25.0±0.5)℃、湿度(40.0±0.5)%、光照周期为12h的培养箱中培养[10]。

1.2 实验试剂腺嘌呤购于北京索莱宝生物科技有限公司，酵母购于英联马利(英国联合食品集团)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及干预 收集羽化后8h内果蝇1360只，雌雄各半；根据前期预实验，本研究共设4个实验组，分别为标准培养基的对照组、腺嘌呤浓度为0.1%的低浓度干预组、腺嘌呤浓度为0.2%的中浓度干预组和腺嘌呤浓度为0.3%的高浓度干预组；每组340只果蝇，其中雌性和雄性果蝇各170只，100只用于体内UA水平的测定，240只用于爬行能力的测定。

1.3.2 果蝇体内UA水平的测定 测定方法参照课题组前期已发表文章[11]，每组取果蝇25只并称重，按重量(g)：蒸馏水(mL)=1：9的比例，用玻璃匀浆器制成组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液，利用ELISA法检测UA水平[10]。

1.3.3 果蝇爬行能力的测定 将用于爬行能力测定的果蝇按照性别分为2组，每组120只，每组重复测试6次取平均值。根据课题组前期果蝇寿命实验，高浓度干预组雄性果蝇的平均寿命为(6.16±2.11)d，雌性果蝇的平均寿命为(7.04±2.23)d，故本研究的实验周期定为7d。爬行能力测试标准线设为8cm，时间为5s。

1.4 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据分布检验结果为正态性的计量资料以“均数±标准差”描述，各实验组数据的组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；计数资料的比较采用卡方检验或卡方连续校正检验；检验水准α=0.05。果蝇爬行能力的测定结果采用Z评分法进行数据标准化后再进行统计学分析。

2 结果

2.1 各组果蝇体内UA水平随着培养基中腺嘌呤浓度的升高，各干预组果蝇体内的UA水平逐渐升高，且与同性别对照组比较，其差异具有统计学意义(P<0.01)。另外，我们分析了相同干预条件下不同性别果蝇体内UA水平的差异，与同干预组雌性果蝇比较，对照组、低浓度干预组和中浓度干预组雄性果蝇体内的UA水平均显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)；高浓度干预组则相反，与同干预组雌性果蝇比较，雄性果蝇体内的UA水平显著降低，其差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1、图1。

表1 各组不同性别果蝇体内UA水平

图1 各组果蝇体内UA水平

2.2 各组果蝇生存率比较对照组和低浓度干预组果蝇的生存状态基本没有变化，出现死亡往往是由于实验操作失误所造成；但随着培养基中腺嘌呤浓度的不断升高，果蝇的生存率出现下降的趋势，尤其是高浓度干预组果蝇，其生存率仅为59.17%，显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、表3。另外，随着培养基中腺嘌呤浓度的不断增加，雄性果蝇的死亡数量明显高于雌性果蝇；尤其是高浓度干预组，雌性和雄性果蝇的生存率分别为80.83%和37.50%，两者差异显著，具有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表2 各组果蝇生存率(n,%)

表3 各组果蝇生存率比较

表4 各组相同干预组雌雄性果蝇生存率比较(n=120)

2.3 UA对各实验组果蝇爬行能力的影响随着培养基中腺嘌呤浓度的不断升高，与对照组比较，各干预组果蝇的爬行能力均有不同程度的降低；中浓度干预组和高浓度干预组果蝇的爬行能力显著降低，与同性别对照组比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)。另外，我们分析了相同干预条件下不同性别果蝇爬行能力的差异，与雌性果蝇比较，对照组、低浓度干预组和中浓度干预组雄性果蝇的爬行能力变化不明显，其差异无统计学意义(P>0.05)；但高浓度干预组雄性果蝇的爬行能力与雌性果蝇比较显著降低，其差异有统计学意义(P<0.01)。见表5、表6。

表5 UA对果蝇爬行能力的影响

表6 UA对果蝇爬行能力影响结果的Z评分法标化数据表

3 讨论

本次研究发现，随着培养基中腺嘌呤浓度的升高，果蝇体内的UA水平逐渐升高，提示果蝇HUA模型构建成功。我们的研究结果显示：随着果蝇体内UA水平的逐渐升高，果蝇的生存率不断降低，这一结果与我们课题组前期研究一致[11]。另外，果蝇的爬行能力随着体内UA水平的升高却出现不同程度的下降，尤其中浓度干预组和高浓度干预组果蝇的爬行能力显著低于同性别对照组，这种现象可能与体内UA水平升高诱发炎症反应有关，进而影响果蝇的爬行能力。有研究显示，尿酸盐晶体在人体内可激活Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein3,NLRP3)炎症信号通路[12]，促进NLRP3炎症小体的形成，通过调节Caspase-1蛋白酶的活性，剪切IL-1β前体蛋白，促使IL-1β成熟和释放，诱发痛风性关节炎及慢性肾损伤的发生[13-16]。故我们推测，在果蝇HUA模型中，UA通过诱发炎症反应的发生导致果蝇行动障碍。

另外，我们分析了相同干预条件下不同性别果蝇爬行能力的差异，发现高浓度干预组雄性果蝇的爬行能力与雌性果蝇比较显著降低，提示雌激素在尿酸代谢及炎症反应过程中扮演着重要的角色，这与课题组前期完成的一项研究结果一致[10]。这一结果为我们进一步探讨雌激素对尿酸的调节作用及其机制提供了参考，为揭示HUA的病因提供了新思路，为临床治疗HUA提供了新的可能。

综上所述，我们将进一步观察果蝇HUA模型中炎症相关因子的变化情况，探讨UA的致炎作用及其机制，揭示其诱发果蝇爬行障碍的具体机制，同时，还将开展雌激素对UA体内代谢的影响及其机制研究。