顺铂对人NK/T细胞淋巴瘤SNK6和NK92细胞株的杀伤作用

赵 玉，潘新宇，李 冀，于成龙，于建渤

(1.黑龙江省肿瘤疾病防治重点实验室；2.牡丹江医学院附属红旗医院病理诊断中心，黑龙江 牡丹江 157011)

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(extranodal nasal type NK/T-cell lymphoma,ENKTCL-N)是一类具有特殊形态、免疫表型和生物学行为，并与EB病毒感染关系密切的侵袭性肿瘤。该肿瘤在西方国家少见，在亚洲、墨西哥和中南美洲等地区相对常见[1-3]。因此，进一步从分子水平阐明该肿瘤的发生、发展机制能够为抗肿瘤治疗提供理论依据。顺铂是一种无机铂衍生物，用于治疗多种癌症，包括膀胱癌、卵巢癌、肺癌和睾丸癌[4]。顺铂通过两个氯化物离去基团之一的水合而在细胞内被激活，然后它与DNA加合物共价结合。DNA修饰激活多种细胞内途径，包括DNA损伤识别和修复、细胞周期阻滞和程序性细胞死亡/凋亡[5-6]。本文通过检测顺铂对人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK6和NK92的杀伤作用，探讨顺铂的杀伤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料细胞株NK92(NK/T细胞淋巴瘤)购自美国ATCC公司；SNK6细胞株(NK/T细胞淋巴瘤)为美国City of Hope National Medical Center陈荣宗教授赠送；RPMI-1640培养液和胎牛血清购于美国Gibco生物公司；人白细胞介素-2(IL-2)购于R&D公司；增强型CCK-8购于上海尚宝生物科技有限公司；顺铂(Cisplatin)和N,N-Dimethylformamide(DMF)购于美国Selleck生物科技公司；RNA提取试剂盒购自Omega公司；引物购自上海生工生物工程股份有限公司；逆转录试剂盒、CO2培养箱和7500实时荧光定量PCR系统均购自美国Thermo公司；SpectraMax M3多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NK92细胞株在含有10%的胎牛血清、1%青霉素/链霉素和100 U/mL IL-2的RPMI-1640培养基中培养。SNK6细胞株在含有10%的胎牛血清、1%青霉素/链霉素和600 U/mL IL-2的RPMI-1640培养基中培养。NK92和SNK6细胞均于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，根据细胞生长情况，更换培养液，取对数期细胞进行实验。

1.2.2 CCK-8检测细胞活性 将细胞按照2×105细胞/孔的密度接种于96孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640制成单细胞悬液，按梯度浓度加入顺铂，使其终浓度为2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、12.5μM，置于37℃，5%CO2的条件下培养。每组设5个复孔，分别于培养后24h、48h和72h迅速加入10 μL增强型CCK-8试剂。37℃孵育4h，于酶标仪490 nm处检测OD值。将各测试孔的OD值减去调零孔OD值。各平行孔的OD值取平均数。根据以下公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(加药组OD平均值/对照组OD均值)×100%。

1.2.3 RT-qPCR检测顺铂处理后凋亡相关基因和JAK3、STAT3的表达 按照E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit说明书从培养的细胞中分离总RNA。将1μg总RNA利用Transcriptor First Strand cDNA试剂盒合成cDNA第一条链，利用Fast SYBR green PCR master mix(Roche)通过引物序列进行扩增。引物序列见表1。反应体系见表2。反应条件如下：20μL反应体系，95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸10min。进行40个循环。每个样品重复3次，依据 2-△△CT法计算各样本mRNA的相对表达量。GAPDH为内参基因。

表1 RT-qPCR引物序列

表2 RT-qPCR反应体系

1.3 统计学分析应用Graphpad Prism 5.0统计软件，实验数据均以“均数±标准差”表示，两组间差异性比较采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NK/T细胞淋巴瘤细胞株培养情况和形态观察镜下，SNK6和NK92细胞均在培养基中成簇、悬浮生长，细胞形态为圆形或类圆形，状态良好(见图1)。

图1 显微镜下细胞形态(A、C：×200;B、D：×400)

2.2 顺铂对SNK6和NK92细胞增殖的抑制作用结果显示，顺铂用药组对SNK6和NK92细胞增殖抑制率均明显高于对照组(P<0.05)。随着顺铂浓度的增加，各组细胞的活性的抑制率均显著增加(P<0.05)。同一用药组内顺铂作用时间越长，SNK6和NK92细胞的存活率均越低(P<0.05)(见图2)。

图2 顺铂对SNK6和NK92细胞增殖的抑制作用

2.3 RT-qPCR检测顺铂处理后Bax和Bcl-2的mRNA表达顺铂用药后SNK6和NK92细胞的促凋亡基因Bax表达增加，而凋亡抑制基因Bcl-2的表达减少，且顺铂高剂量组细胞的凋亡率高于对应低剂量用药组。两组间的比较差异均有统计学意义(A：7.5μM组t=15.28，P=0.0043，15μM组t=22.64，P=0.0019，B：7.5μM组t=19.11，P=0.0027，15μM组t=27.79，P=0.0013，C：7.5μM组t=16.59，P=0.0036，15μM组t=27.95，P=0.0013，D：7.5μM组t=18.97，P=0.0028，15μM组t=28.18，P=0.0013)(见图3)。

2.4 RT-qPCR检测顺铂处理后JAK3和STAT3的mRNA表达与对照组相比，顺铂处理后NK92细胞中JAK3和STAT3的表达减少。两组间的比较差异均有统计学意义(A：5μM组t=24.28，P=0.0017，20μM组t=24.57，P=0.0017，B：5μM组t=15.51，P=0.0041，20μM组t=21.00，P=0.0023，C：5μM组t=14.34，P=0.0048，20μM组t=21.45，P=0.0022)(见图4)。

图4 顺铂处理后JAK3、STAT3的mRNA表达

3 讨论

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤进展快，生存时间短，预后差，可通过早期诊断和早期治疗加以改善[7]。大多数抗癌疗法，包括药物和化学疗法，都是通过促进细胞凋亡来靶向癌细胞的[8]。凋亡被认为是细胞发育、分化和死亡中的重要现象。生理过程的失调可导致细胞异常积累，被认为是肿瘤形成的主要机制之一。细胞增殖和凋亡均是多因素的复杂过程，同时受到原癌基因和抑癌基因的双向调控。BCL家族蛋白是维持线粒体功能和膜完整性所必需的。Bax和Bcl-2是BCL蛋白家族中最典型的成员，控制线粒体参与凋亡信号转导[9-10]。Hogarth等[11]研究发现Bax的高表达与儿童急性淋巴细胞白血病的复发风险增加相关。Bax的高表达也与急性髓细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤的不良预后有关[12-13]。而抗凋亡蛋白，如Bcl-2，通过隔离促凋亡蛋白发挥作用，阻止促凋亡蛋白与促凋亡激活因子Bax和/或Bak结合并诱导细胞凋亡[14]。

化疗可能导致细胞色素c从线粒体释放，激活caspase-3,PARP切割，并诱导细胞凋亡。在生物膜中，Bcl-2可以形成离子通道，可以通过影响细胞内膜的通透性并从而将线粒体内容物释放到细胞质中来控制细胞凋亡[15]。Bcl-2蛋白家族控制死亡信号的几个关键步骤，因为它们可以保护细胞免受化疗、放疗或生长因子剥夺引起的死亡[16]。

顺铂是一种以铂为基础的抗肿瘤药物，是最广泛使用的化疗药物之一。顺铂通过在细胞核DNA中形成铂化产物发挥抗肿瘤作用[17]。细胞死亡是由多种刺激导致的，包括细胞外(细胞因子激活死亡受体)和细胞内(ROS介导的线粒体损伤)[18]。顺铂可破坏线粒体动力学，导致线粒体破碎，细胞损伤甚至死亡[19]。顺铂在体外诱导细胞死亡的机制是剂量依赖性的，低剂量诱导细胞凋亡，高剂量诱导坏死[20-21]。不少研究报道表明抗凋亡线粒体蛋白Bcl-2在顺铂的作用下被下调[19,22-23]。

JAK/STAT通路密切参与了淋巴瘤的病理过程，JAK通路的异常活化在T细胞淋巴瘤形成和化疗耐药中发挥重要作用。STAT3是转录因子家族的一员，它介导对多种细胞因子、趋化因子和生长因子的应答，并调节参与调节多种重要功能的基因的转录，主要包括细胞存活、转移、迁移、血管生成，化疗耐药与免疫应答[24]。Chen等[25]研究发现PTPRK与STAT3结合并在Tyr705处直接使p-STAT3去磷酸化。位于缺失的6q区域的PTPRK丢失会导致STAT3活化，并参与鼻型NK/T细胞淋巴瘤发病。Montes-Mojarro等[26]通过免疫组织化学染色发现，STAT3突变病例显示出均一且强烈p-STAT3染色，相比之下，STAT3野生型病例显示p-STAT3异质且较弱的染色，提示STAT3突变被预测为组成性激活的STAT3蛋白。此外，Sun等[27]研究表明，miR-10a可以促进Smad2，STAT3和STAT5以及HIF和eIF4E的下游转录因子的活性，从而在A549细胞中诱导顺铂(DDP)抗性。抑制STAT3信号传导可诱导原发性渗出性淋巴瘤细胞系凋亡并降低survivin表达，鼻腔NK/T细胞淋巴瘤中STAT3和survivin表达之间呈正相关[28]。之前的研究表明，抗凋亡基因Bcl-2的表达水平与p-STAT3水平呈正相关，提示STAT3激活通过调节Bcl-2家族在抑制细胞凋亡和促进增殖中起关键作用[29-30]。与之前的研究一致，STAT3调节抗凋亡基因BCL-2家族的转录，顺铂处理可降低其在耳蜗中的表达水平[31-32]。Rosati等[33]通过Western blot分析发现，顺铂处理可降低UB/OC1细胞中STAT3及p-STAT3的表达，导致STAT3的失活。此外，通过免疫染色发现，顺铂治疗降低了细胞核中p-STAT3的水平，表明顺铂可能会破坏STAT3介导的转录。本研究发现顺铂对SNK6和NK92细胞的增殖抑制率明显高于对照组，且具有时间和剂量依赖性。顺铂用药后SNK6和NK92细胞的促凋亡基因Bax表达增加,而凋亡抑制基因Bcl-2的表达减少，且顺铂高剂量组细胞的凋亡率高于对应低剂量用药组，初步探讨了顺铂对人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK6和NK92的杀伤作用。JAK/STAT 信号通路的磷酸化水平，标志该通路的激活程度，因此抑制其磷酸化可以调节该通路活性，改善疾病。

综上，顺铂诱导的STAT3失活可能损害抗凋亡基因的转录，从而增强细胞对顺铂毒性作用的敏感性。顺铂可能诱导JAK/STAT信号通路中靶基因的调节(Bax，Bcl-2),促进细胞凋亡。因此，提示顺铂诱导的细胞凋亡可能归因于STAT3依赖性基因的上调或下调及其信号转导。JAK3/STAT3途径的抑制可以作为NK/T淋巴瘤的治疗选择。