苗药加九留对骨折愈合的修复作用

陈常荣，魏学军，赵鸿宾，王 恒，许键炜

(1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀558013；2.贵州医科大学 基础医学院药理学教研室，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550004)

近年来，随着创伤所致骨折越来越多，其康复受到人们越来越多的关注和临床的重视。苗药加九留又名四块瓦，为金粟兰科植物宽叶金粟兰(ChloranthushenryiHemsl)的根。该植物生于山野林下阴湿处和灌丛中，贵州东部地区有较多资源，具有舒经活络、清热解毒、祛风止痛、消肿等功效，因此在无名肿毒、肺结核、风湿痹痛、发热、跌打损伤、骨折等的治疗中具有较好的效果[1]。本研究主要探讨其对骨折愈合及软组织损伤后的修复效果，现报道如下。

1 动物与试剂

1.1 实验动物

选取成年体重为200～240 g的100只SD大鼠为实验动物，由贵州医科大学动物实验中心提供。

1.2 实验用药

购买苗药加九留，经相关专家鉴定为宽叶金粟兰的根。取苗药加九留5 kg，加60%乙醇加热回流提取2次，合并滤液，将乙醇回收，等水溶液缩至一定体积后，将明胶沉淀杂质加入一种，用乙醇将多余明胶除去，并将乙醇回收，水溶液析出无色结晶，该结晶的水溶液即为本次实验中使用的药物苗药加九留。

2 实验方法

2.1 分组

将100只SD大鼠随机分为苗药加九留高剂量组、苗药加九留低剂量组、模型组、假手术组。每组25只，实验结束保证每组存活20只以上。

2.2 建模

向大鼠腹腔中注射40 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，并使其处于仰卧位后固定，将其左后肢的毛发去除，对其皮肤进行消毒，于左后肢胫骨粗隆下外侧，纵行做一个1.5～2 cm的切口，将肌肉组织分离，使胫骨充分暴露出来，在胫骨粗隆下约1 cm处，使用特制钢锯横向将胫骨锯成3 mm宽、2 mm深的骨缺损，然后缝合，包扎伤口，但不固定。其中假手术组在建模时不做骨损伤，其余同上。

2.3 给药

各组手术后开始均灌胃给药，每日1次。其中模型组和假手术组灌胃蒸馏水20 mL/kg，苗药加九留高剂量组为20 mg/kg，苗药加九留低剂量组为10 mg/kg。灌胃容积均为20 mL/kg，连续灌胃28 d。

2.4 观察指标

2.4.1 骨折肢X线评分[2]四组大鼠接受治疗7、14、21、28 d后均接受X线片拍摄，观察其变化特征：①错位：已缺损胫骨无错位或者包括错位<0.1 cm记为1分；否则记为0分。②骨折缝：已缺损胫骨骨折缝部分模糊或消失记为1分；否则记为0分。③连接：已缺损胫骨骨折断端连接为一整体记为1分；否则记为0分。④愈合：骨折愈合记为1分；否则记为0分。

2.4.2 BMP-7 采用免疫组化S-P法染色观察骨形态发生蛋白7(BMP-7)在骨愈合标本细胞中的表达。

2.4.3 骨折愈合组织抗折强度 末次给药后次日，每组用10只SD。乙醚麻醉处死动物，剖取骨折肢腿骨，固定股骨端，以胫骨骨折处作支点，在距支点10 mm处用便携秤施压，记录胫骨骨折处断裂时承受的压力。

2.4.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) 大鼠麻醉后，经腹主动脉取血(4 mL)，普通离心机4 000 r/min离心10 min，分离血清。采用双抗夹心ELISA试剂盒测定大鼠碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和转化生长因子(transforming growth factor，TGFβ1)含量。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠骨折肢X线评分比较

苗药加九留高剂量组、低剂量组大鼠骨折X线评分明显高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠骨折肢X线评分比较

3.2 各组大鼠骨愈合标本细胞BMP-7表达水平比较

运用Image-ProPlus6.0软件对各组各时点的免疫组化图像进行分析，测定BMP-7平均光密度(MOD)值，结果表明苗药加九留高剂量组、低剂量组大鼠BMP-7表达水平均明显高于模型组，异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠骨愈合标本细胞中BMP-7表达A值比较

3.3 各组大鼠抗折强度比较

苗药加九留高剂量组、低剂量组大鼠愈合组织抗折强度明显高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠骨折愈合组织抗折强度比较

3.4 各组大鼠血清bFGF和TGFβ1水平比较

苗药加九留高剂量组、低剂量组、模型组大鼠bFGF表达水平显著高于假手术组(P<0.05)；与模型组比较，苗药加九留高剂量组、低剂量组大鼠bFGF表达水平显著升高(P<0.05)。苗药加九留高剂量组、模型组大鼠TGFβ1表达水平显著高于假手术组(P<0.05)；与模型组比较，苗药加九留高剂量组、低剂量组大鼠TGFβ1表达水平显著升高(P<0.05)，差异均具有统计学意义。见表4。

表4 各组大鼠血清bFGF和TGFβ1水平比较

4 讨论

苗药加九留具有舒经活络、祛风止痛、清热解毒、消肿等功效，可用于肺结核、无名肿毒、跌打损伤、风湿痹痛、发热、骨折等的治疗。研究发现，宽叶金粟兰根中分离鉴定出8个化合物，分别为curcolonol(Ⅰ)、zedo arofuran(Ⅱ)、shizukanolide E(Ⅲ)、异嗪皮啶-7-O-葡糖苷(Ⅳ)、伞形花内酯苷(Ⅴ)、异嗪皮啶-3-D-芹菜糖(1→3)-D-葡糖苷(Ⅵ)、谷甾醇(Ⅶ)、胡萝卜苷(Ⅷ)[3]，现代医学研究发现其具有收缩子宫的作用[4]。苗药加九留在民间的使用仅仅停留在经验方上面，缺少理论和实验基础支撑。本研究结果表明苗药加九留可以促进大鼠骨折端 软骨细胞骨化，进而有效促进骨折愈合。此外，苗药加九可以促进大鼠骨折折断软骨端骨膜反应以及骨痂生成，并促进骨痂质量的提高，进而实现骨折愈合组织抗折断力的提高。骨折愈合是机体对创伤修复的复杂过程，影响骨折愈合的因素很多。目前研究较多的骨生长因子有骨形态发生蛋白7(BMP)[5-6]。BMP-7在诱导成骨过程中，可以有效刺激成骨蛋白DNA、胶原合成及蛋白质积聚增殖，进而促使骨折修复[7-8]。bFGF具有广泛的有丝分裂和细胞存活活性，参与胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭等多种生物学过程。研究显示，bFGF还能通过与bFGF-1受体结合并激活磷酸肌醇3激酶的形式，以加速增殖的血清形式作用于成骨前细胞[9]。转化生长因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β)也是参与骨愈合和骨生成的一种重要的细胞因子；TGF-β是属于转化生长因子超家族的多功能细胞因子，其受体由1型和2型受体亚基组成。在与TGF-β结合后，2型受体激酶磷酸化并激活信号级联的1型受体激酶，导致不同的下游底物和调节蛋白的激活，诱导不同靶基因的转录，在许多免疫细胞的分化、趋化、增殖和活化有重要作用[10]。

本研究表明，苗药加九留对实验性大鼠骨折有促进愈合的作用，可能是通过提高BMP-7、bFGF、TGF-β的表达促进骨折愈合。