吴茱萸敷贴涌泉穴干预失眠机制实验研究

李恒飞，肖明中，黄晶晶，徐 曦，吕 艺，彭 苗，黄大伟

(湖北省中医院 肝病科，湖北 武汉 430074)

失眠是当今社会发生率较高的疾病之一，入睡困难、睡眠质量差会严重影响患者的日常生活，引发焦虑，严重者可导致抑郁，甚至产生自杀倾向。而住院病人的失眠发生概率较正常人明显升高，尤其是慢性肝病病人，失眠发生率达50%以上[1-2]。

苯二氮卓类镇静催眠药是目前临床应用最广泛的抗失眠药物，具有抗焦虑、镇静催眠的作用，能有效缓解失眠症状，但其不良反应也较多，除了常见的中枢神经系统抑制、宿醉作用，大剂量或长期应用易致反跳性症状、耐受性、撤药症状、成瘾性外，由于其主要通过CYP450和葡糖醛酸结合代谢[3]，还可直接或间接导致肝细胞坏死，也可作为氧化剂或脂质过氧化物引起慢性肝损伤[4]。因此，研究安全、有效的抗失眠制剂是我们需要解决的问题。

吴茱萸敷贴涌泉穴是湖北省中医院肝病科的经验方，本方是基于中医交通心肾理论，方用吴茱萸、酸枣仁、合欢皮磨成粉，加醋制成敷贴于人体涌泉穴，以沟通心肾、水火既济。前期的临床试验已经验证吴茱萸敷贴在延长睡眠时间、提高睡眠质量、减少日间功能障碍方面优于艾司唑仑[5]。在前期研究基础上，笔者通过腹腔注射PCPA诱导建立大鼠失眠模型，观察吴茱萸敷贴涌泉穴对失眠大鼠单胺类神经递质的影响，探讨其治疗失眠可能的作用机制，为临床进一步优化应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠60只，SPF级，8周龄，雌雄各半，8周龄，体重150 ～180g，购自湖北省实验动物研究所(合格证号：NO.42000600028700)。

1.2 主要药物及试剂

对氯苯基丙氨酸(PAPC)购自酷尔化学科技(北京)有限公司，批号EJ006530，在弱碱性环境下配制成悬混液。吴茱萸敷贴药物组成为吴茱萸、酸枣仁、合欢皮，均购自湖北省中药材公司，研磨成粉，以白醋配制成糊状。艾司唑仑片购自湖北省中医院。5-HT(5-羟色胺)、5-HIAA(5-羟吲哚乙酸)、NE(去甲肾上腺素)试剂盒均购自武汉拓捷生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

超低温冰箱SANYC(-70 ℃、-20 ℃)；超低温高速离心机(美国)二氧化碳孵育箱SHEL-LAB(美国)；高速台式离心机L9L-10；酶联免疫检测仪CD3022A；水浴锅TL-420D；光学读数分析天平TG328B；高效液相色谱仪LC-4A(日本)；气相色谱仪GL07A(日本)；紫外分光光度计WP；全自动组织切片机；全自动超薄切片机；超净工作台GHOI-I(国产)。

1.4 动物分组及处理

将60只SD大鼠随机分为6组，正常组、模型组、吴茱萸敷贴组、艾司唑仑组、吴茱萸敷贴+艾司唑仑组、生理盐水对照组，每组10只。各组大鼠适应性饲养2天后，除正常组外，其余5组腹腔注射450 mg/kg的PAPC混悬液，连续注射2天，于第1次腹腔注射28～30 h后，大鼠出现昼夜节律消失，白天夜晚活动不停，表明模型复制成功。并于第3天开始给药，吴茱萸敷贴组大鼠每天给予涌泉穴敷贴治疗1次，每次贴敷时间为10min，连续敷贴5天；艾司唑仑组大鼠按0.92 mg·kg-1·d-1剂量给予艾司唑仑灌胃治疗，连续5天；吴茱萸敷贴+艾司唑仑组大鼠每天给予涌泉穴敷贴治疗1次，每次贴敷时间为10 min，同时按0.92 mg·kg-1·d-1的剂量给予艾司唑仑灌胃治疗，连续5天；生理盐水对照组大鼠连续5天给予等剂量生理盐水灌胃；模型组大鼠除腹腔注射PCPA外不做任何处理。末次敷贴及灌胃后12 h，脱颈处死大鼠，取出下丘脑，在冰冷生理盐水中洗去血液，组织称重后，对5-HT、5-HIAA、NE进行检测。

1.5 指标测定

分别采用Western Blot法、ELISA法检测大鼠下丘脑内5-HT、5-HIAA、NE的含量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠造模后睡眠变化情况

于第1次腹腔注射PCPA 28～30 h后，大鼠出现昼夜节律消失，白天夜晚活动不停，表明模型复制成功。

2.2 各组大鼠下丘脑5-HT、5-HIAA、NE含量变化情况

与正常组比较，模型组、艾司唑仑处理组、吴茱萸敷贴治疗组、吴茱萸敷贴+艾司唑仑组、生理盐水对照组大鼠的5-HT、5-HIAA的含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较，艾司唑仑处理组、吴茱萸敷贴治疗组、吴茱萸敷贴+艾司唑仑组大鼠5-HT、5-HIAA的含量明显升高(P<0.01)。与艾司唑仑处理组比较，吴茱萸敷贴治疗组、吴茱萸敷贴+艾司唑仑组大鼠5-HT、5-HIAA的含量也明显升高(P<0.01)。与吴茱萸贴治疗组比较，吴茱萸敷贴+艾司唑仑组5-HT、5-HIAA的含量明显升高(P<0.01)。以上结果提示，吴茱萸敷贴的确能增加失眠大鼠下丘脑5-HT、5-HIAA的含量，且作用优于艾司唑仑处理组；而吴茱萸敷贴联合艾司唑仑的效果优于单纯运用吴茱萸敷贴，说明吴茱萸能增强艾司唑仑治疗失眠的疗效。见表1。

表1 各组大鼠下丘脑5-HT、5-HIAA含量变化比较

与正常组比较，模型组、艾司唑仑处理组、吴茱萸敷贴治疗组、吴茱萸敷贴+艾司唑仑组、生理盐水对照组下丘脑NE含量均显著降低(P<0.01)。与模型组比较，艾司唑仑处理组、吴茱萸敷贴治疗组、吴茱萸敷贴+艾司唑仑组下丘脑NE含量显著降低(P<0.01)。与艾司唑仑处理组比较，吴茱萸敷贴治疗组下丘脑NE含量有所下降(P<0.05)，而吴茱萸敷贴+艾司唑仑组下丘脑NE含量则显著降低(P<0.01)。与吴茱萸贴治疗组比较，吴茱萸敷贴+艾司唑仑组下丘脑NE含量显著降低(P<0.01)。以上结果说明，吴茱萸敷贴降低失眠大鼠下丘脑NE含量的作用优于艾司唑仑处理组，而吴茱萸敷贴联合艾司唑仑组则能使下丘脑NE含量得到进一步的降低。见表2。

表2 各组大鼠下丘脑NE含量比较

3 讨论

人类的睡眠过程依据脑电图表现、眼球运动情况及肌张力变化可分为快速动眼睡眠(REM)和非快速动眼睡眠(NREM)，REM和NREM在睡眠过程中交替出现。5-HT又称血清素，是人类发现最早、研究最多的与睡眠觉醒有关的神经递质之一[6]。研究发现5-HT是促进睡眠的重要神经递质，脑内高含量5-HT是睡眠发生必须的，而失眠病人常见5-HT降低[7]。5-HIAA是5-HT在细胞内被单胺氧化酶降解后的代谢产物，由于5-HT被降解，检测5-HT的含量不能完全反映五羟色胺能神经元的兴奋性，现在多用5-HIAA/5-HT(即 5-HT转换率)作为反映五羟色胺能神经元的兴奋性的指标[8]。脑内的NE能神经纤维主要集中在蓝斑(LC)，在维持觉醒上具有重要作用，有学者研究发现摧毁大鼠的蓝斑头部，大鼠觉醒状态减少[9]。

吴茱萸敷贴由吴茱萸、酸枣仁、合欢皮加白醋调配而成。吴茱萸主入肾经、心包经，具有安神定志的效果，酸枣仁补心肝之阴血安神，合欢皮解郁安神，三者共奏安神定志、交通心肾之功，加入白醋有利于渗透皮肤。涌泉穴位于足底，为足少阴肾经的井穴，常用于治疗失眠等疾病[10]。本研究发现艾司唑仑组、吴茱萸敷贴组、吴茱萸敷贴+艾司唑仑组大鼠5-HT、5-HIAA含量较模型组上升，而NE含量下降，表明艾司唑仑灌胃和吴茱萸敷贴涌泉穴均可通过兴奋五羟色胺能神经元，抑制蓝斑从而改善失眠。而吴茱萸敷贴组大鼠5-HT、5-HIAA含量较艾司唑仑组升高明显，NE含量下降明显，表明吴茱萸敷贴涌泉穴在促进五羟色胺能神经元兴奋，抑制蓝斑的作用上优于艾司唑仑灌胃。吴茱萸敷贴+艾司唑仑组大鼠5-HT、5-HIAA含量上升水平及NE含量下降水平高于单用艾司唑仑组和吴茱萸敷贴组，表明二者具有协同作用。本研究表明吴茱萸敷贴涌泉穴治疗失眠的效果优于艾司唑仑，且二者合用具有协同效应，作用机制可能是兴奋五羟色胺能神经元，抑制蓝斑从而改善失眠。