阔叶十大功劳根提取物对糖尿病模型小鼠降糖作用研究

曹国琼，洪 林，张永萍

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷和/或其生物作用受损引起，已成为严重威胁人类健康的重大疾病[1-2]。近年来由于人们生活节奏加快、生活方式的改变，代谢性疾病的发病率正在不断上升。国际糖尿病联盟统计数据显示，2013年全球糖尿病患者约4.15亿，到2040年可能达到6.42亿[3]。目前西药治疗糖尿病主要有二甲双胍、噻唑烷二酮类药物、胰高血糖素样肽类似物和α葡萄糖苷酶抑制剂等，但均存在一定的副作用，如造成腹部不适或腹痛腹泻，乳酸中毒，肝肾功能衰竭[4]。寻找有效治疗糖尿病且副作用少的药物是广大医药工作者的责任。中药、民族药使用历史悠久，着重整体调节，不良反应少，价格相对低廉，可从中寻找DM预防和治疗药物[5-6]。

阔叶十大功劳俗名又叫土黄连、老虎刺、刺黄连、土黄柏，为小檗科植物阔叶十大功劳Mahoniabealei(Fortune)Carr.的叶、根，是贵州苗族常用药[7]。阔叶十大功劳具有清热燥湿、泻火解毒的功效，主要用于湿热泻痢、黄疸、目赤肿痛、胃火牙痛、黄疸型肝等疾病的治疗[8]。根据苗药药性理论，其性冷，属热经，无毒，质征苦，入肺、肚、肾三脏。苗药的治疗原则为热病冷治，阔叶十大功劳可用于治疗热病。现代药理学研究表明，阔叶十大功劳主要含生物碱类成分，如小檗碱、巴马亭、氧化小檗碱、黄连碱等，这些化学成分与黄连所含成分相似，故常被用作黄连的替代品[9]。药理研究表明，黄连具有降血糖的作用，其所含小檗碱通过提高胰岛素受体的表达、促进糖酵解、增强胰岛素敏感性、促进胰岛素的释放与分泌、增加肝细胞对葡萄糖的消耗等途径在降糖方面发挥重要作用[10-12]。因此，研究阔叶十大功劳的降血糖作用，有利于其资源的开发利用。阔叶十大功劳根的抗糖尿病研究还未见报道，本实验主要研究阔叶十大功劳根提物的降血糖活性及其可能的作用机制。

1 材料

1.1 药材与试剂

样品采自贵州清镇，经贵州中医药大学中药民族药资源研究院肖承鸿老师鉴定为小檗科十大功劳属植物阔叶十大功劳Mahoniabealei(Fortune.)Carr.，根烘干，粉碎成粗粉，过一号筛备用；盐酸二甲双胍片(昆山培力药品有限公司，生产批号：1703036)；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；链脲佐菌素(STZ，批号79C-0027)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醇(MDA)均购于南京建成生物工程研究所(批号20190710)；还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒购于索莱宝生化试剂公司(批号20190712)。

1.2 实验动物

健康昆明小鼠清洁级50只，雌雄各半，体质量25～30 g，购于重庆腾鑫生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(军)2012-0011。

1.3 主要仪器

血糖测试仪(可孚)；METTLER AE240型电子分析天平(瑞士梅特勒)；BIO-RAD酶标仪(美国伯乐)；恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；JM-A10002型电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司)；HBM-109型粉碎机(瑞安市瀚博机电有限公司)；RE52-99型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器有限公司)。

2 方法

2.1 阔叶十大功劳根提取物制备

水提物的制备：称取一定量的阔叶十大功劳根粗粉，分别用10、8倍量的水煎煮提取2次，每次1 h，合并滤液，减压回收蒸干，即得水提物。醇提物的制备：称取一定量阔叶十大功劳根粗粉，分别用10、8倍量的乙醇回流提取2次，每次1 h，合并滤液，减压回收蒸干，即得醇提物。提取物放入4 ℃冰箱中备用，临用前稀释成所需浓度。

2.2 糖尿病小鼠模型制备、分组与给药[13]

采用柠檬酸缓冲液配制STZ溶液，浓度为150 mg/10 mL，现配现用。小鼠适应性喂养1周后，实验组小鼠腹腔注射STZ，注射量10 g/0.1 mL，正常对照组小鼠腹腔注射等体积的上述缓冲溶液，注射前均禁食不禁水12 h，注射后禁食禁水。于注射STZ 3 d后取尾静脉血测小鼠的血糖值，血糖值高于11 mmol/L，认为造模成功。将造模成功的糖尿病小鼠分为4组，每组8只，雌雄各半，分别为模型组、阳性对照组(盐酸二甲双胍组)、水提物组(阔叶十大功劳根)、乙醇提物组(阔叶十大功劳根)。每天灌胃给药1次，正常组和模型组灌胃给予等量的蒸馏水，给药后6 h恢复正常给食，连续28 d。

2.3 检测指标

小鼠连续灌胃给药4周，每周测定小鼠体重。

小鼠空腹血糖检测：从给药第1天起，每7天最后一个晚上禁食不禁水，于第2天早上尾部采血，测定其空腹血糖值，连续4周观察小鼠血糖变化。灌胃4周结束后摘眼球采血，离心取血清待测；处死小鼠，迅速取肝脏，-80 ℃冻存。

小鼠血清和肝脏生化指标检测：按照试剂盒的操作步骤分别检测各组小鼠血清中三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，以及血清及肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)及过氧化物丙二醛(MDA)水平。

2.4 数据分析

3 结果

3.1 阔叶十大功劳根提取物对小鼠体重变化的影响

对照组小鼠正常饲养，体重逐渐增加，模型组小鼠造模成功后日渐消瘦，造模两周后与对照组比较体重显著降低(P<0.05)。与模型组比较，阳性药组小鼠给药4周后体重显著增加(P<0.05)，阔叶十大功劳提取物对小鼠的体重影响不大，与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 阔叶十大功劳根提取物对小鼠体重变化的影响

3.2 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠血糖变化的影响

实验过程中对照组小鼠4周内的血糖均在5～6 mmol/L之间，无明显变化。造模成功后小鼠的空腹血糖明显升高，与对照组比较差异极显著(P<0.01)。给药治疗后，阳性药组，根水提物和醇提物组小鼠血糖均得到控制，二甲双胍、水提物、醇提物给药治疗1周后与模型组比较血糖显著降低(P<0.05)，连续给药4周后阳性药组、醇提物组小鼠与模型组比较血糖出现极显著降低(P<0.01)，血糖值接近对照组。结果见表2。

表2 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠血糖变化的影响

3.3 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠血脂代谢的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著升高(P<0.05)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平极显著降低(P<0.01)。治疗4周后，阳性药组、提取物组小鼠血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著降低(P<0.05)，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平极显著升高(P<0.05、0.01)。见表3。

表3 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠血脂代谢的影响

3.4 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠血清SOD、GSH、MDA的影响

与对照组比较，糖尿病模型组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)水平显著降低(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平显著升高(P<0.05)。治疗4周后，与模型组相比，阳性药组、根提取物组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)水平显著升高(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠血清氧化应激指标的影响

3.5 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠肝脏SOD、GSH、MDA的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)水平显著降低(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平显著升高(P<0.05)。治疗4周后，与模型组比较，阳性药组、根提取物组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)水平显著升高(P<0.05)，丙二醇(MDA)水平显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 阔叶十大功劳根提取物对糖尿病小鼠肝脏氧化应激的影响

4 讨论

糖尿病是一种胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍引起高血糖并伴有血脂异常等特征的代谢性疾病，临床表现为多饮、多尿、多食和消瘦[14-15]。高血糖可导致机体组织如眼、肾、心脏、血管等的慢性损害和功能障碍。糖尿病患者长期碳水化合物、脂肪以及蛋白质代谢紊乱导致糖尿病微血管并发症和大血管并发症的发生，严重威胁人类的健康。研究表明，氧化应激在糖尿病及其并发症的发生和发展中起着重要作用，氧化应激主要通过损伤胰岛β细胞与诱导胰岛素抵抗诱发糖尿病，体内血脂异常会加重氧化应激[16-17]。因此，调节体内异常的血脂水平和抗氧化应激可起到改善或治疗糖尿病的作用。已有文献报道，十大功劳能抑制邻苯三酚的自氧化速度，并能清除Fenton反应产生的羟自由基，其所含多糖和生物碱能清除ABTS·+和DPPH自由基具有抗氧化作用[18-20]。

本实验结果表明阔叶十大功劳根提取物具有一定的降糖作用。在腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型中，灌胃给药阔叶十大功劳根水提物、醇提物治疗后可显著降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖。在调节血脂方面，阔叶十大功劳根提取物能下调糖尿病模型小鼠血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平，上调高密度脂蛋白(HDL-C)水平，具有调节血脂异常的功能。在抗氧化应激方面，阔叶十大功劳根提取物能降低糖尿病小鼠血清中丙二醛(MDA)水平，升高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性，改善氧自由基的氧化损伤。

综上所述，阔叶十大功劳根提取物具有明显的降血糖作用，并能通过降低血清游离脂肪酸水平抑制氧化应激，起到控制血糖的作用，本研究结果为阔叶十大功劳根用于糖尿病的防治提供了依据。