基于质量源于设计理念的山参饮提取工艺研究*

何云华，石红霞，刁本恕，杨 林△

（1. 四川大学华西医院临床药学部，四川 成都 610041； 2. 四川省成都市第七人民医院刁本恕名医工作室，四川 成都 610072）

山参饮为四川省名中医刁本恕主任医师的临床验方，由山药、山楂、郁李仁、人参等10 味中药组方，具有开胃健脾、润肠通便功效，用于肿瘤放化疗、老年病、术后食欲不振、肠道功能差、消化不良、便秘等。该方临床使用已有10 余年，疗效显著，安全性好，为方便服用，将其研制成质量可控的中药颗粒剂。质量源于设计理念是应用质量风险管理知识，重点控制产品的生产工艺，以达到预定目标的产品研发过程，其主要途径是根据关键质量属性，确定关键工艺参数，然后采用多种试验设计方法和数据分析方法开发产品生产工艺［1-4］。目前，质量源于设计理念已应用于中药的干燥［5-6］、包衣［7］等生产过程。本研究中基于质量源于设计理念，优化山参饮提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（包括DAD 检测器，美国安捷伦科技有限公司）；BT25S 型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，精度为十万分之一）；JA2003 型电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司，精度为千分之一）；YPR -10T 型超纯水器（北京英普瑞环保设备有限公司）；AS20500T 型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

山药饮片（批号为18060806，四川禾一天然药业有限公司）；山楂饮片（批号为180927-8），郁李仁饮片（批号为180528-8），麦芽饮片（批号为180829-8），均购自泸州百草堂中药饮片有限公司；人参饮片（批号为180301941），白扁豆饮片（批号为180100032），薏苡仁饮 片（批 号 为 180800871），砂 仁 饮 片（批 号 为180701701），火麻仁饮片（批号为180800781），均购自成都康美药业有限公司；生姜饮片（自制）。所有药材经四川大学华西医院杨林副主任药师鉴定为正品。苦杏仁苷对照品（批号为110820 -201506，质量分数为93.4%，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 有机酸含量测定

参照2015年版《中国药典（一部）》山楂含量测定方法［8］，按处方比例称取药材（山药30 g，山楂12 g，郁李仁10 g，人参3 g，麦芽15 g，白扁豆15 g，火麻仁15 g，薏苡仁30 g，砂仁3 g，生姜3 g）进行煎煮，过滤，取滤液适量，置容量瓶中，加纯水定容，摇匀，加酚酞指示液2 滴，用氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）滴定［每l mL 氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）相当于6.404 mg 的枸橼酸（C6H8O7）］，即得有机酸含量。

2.2 苦杏仁苷含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent extend -C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（12∶88，V/ V）；流速：1.0mL/min；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取苦杏仁苷对照品（质量分数为93.4%）20.02 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成质量浓度为0.747 947 2 mg/mL 的溶液，即得对照品溶液。按处方比例称取药材（山药30 g，山楂12 g，郁李仁10 g，人参3 g，麦芽15 g，白扁豆15 g，火麻仁15 g，薏苡仁30 g，砂仁3 g，生姜3 g）进行煎煮，过滤，取适量滤液，置水浴上蒸干，加甲醇溶解于容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例称取郁李仁以外的其他药材，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2.2 项下3 种溶液，按拟订色谱条件进行测定，记录色谱图。可见，阴性对照无干扰，表明该方法专属性良好。详见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取2.2.2 项下对照品溶液，加甲醇稀释成质量浓度为74.794 72，149.589 44，299.178 88，448.768 32，598.357 76，747.947 20 μg/mL的对照品溶液，按拟订色谱条件进行测定。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1 324.6X-19.127，r=0.999 1（n=6）。结果表明，苦杏仁苷质量浓度在74.79472 ～747.94720μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2.2 项下的对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果苦杏仁苷峰面积的RSD为1.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为180528-8），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，4，6，8，12，24 h 时按拟订色谱条件测定，各进样10 μL，记录峰面积。结果苦杏仁苷峰面积的RSD为1.56%（n=7），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取样品（批号为180528-8），按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液6 份，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果苦杏仁苷峰面积的RSD为2.52%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批（批号为180528-8）样品0.2 g，精密称定，共6 份，精密加入对照品溶液4 mL（质量浓度为1.850 067 2 mg/mL），按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果苦杏仁苷的平均回收率为99.61%，RSD为1.60% （n=6）。

2.3 吸水率计算

吸水率（%） =（处方饮片浸泡后质量-处方饮片浸泡前质量）/处方饮片浸泡前质量×100%

2.4 浸膏得率测定

参照2015年版《中国药典（四部）》浸出物测定法项下方法，精密吸取各试验项下滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算供试品中水溶性浸出物含量和浸膏得率。

2.5 数据处理

根据本研究指标有机酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率在处方中的地位，设定满分为100 分，其权重系数分别为苦杏仁苷含量50，有机酸含量30，浸膏得率20，进行综合评分［9］。综合评分=（苦杏仁苷含量/最大值） ×50+ （有机酸含量/最大值） ×30+ （浸膏得率/最大值） ×20。

2.6 影响因素分析

中药提取过程中会受到多种因素影响，根据预试验研究，结合生产环境，将山参饮提取过程的影响因素归结为5 个方面，将其细化分类绘成鱼骨图（见图2）。其中，环境、饮片、设备和溶剂为客观因素，故本试验对工艺参数进行考察［10］。

图2 山参饮提取工艺鱼骨图

2.7 单因素考察

浸泡时间：以吸水率为指标考察。按处方比例称取饮片100 g，分别置同一规格烧杯中，加10 倍量水，浸泡30，60，90，120，150，180 min，按2.3 项下公式计算饮片的吸水率。结果见图3 A。可见，90 min 前吸水率呈上升趋势，超过90 min 后趋于平稳，故选浸泡时间为60 min和90 min。

加水量：以有机酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率为指标考察。按处方比例称取饮片100 g，置烧杯中，分别加水8，10，12，14 倍，浸泡90 min，提取2 次，每次60 min，依法测定有机酸含量，测定苦杏仁苷含量及浸膏得率。结果见图3 B。可见，加8 ～12 倍水时，各指标呈上升趋势，超过12 倍水后趋于平稳，故选加水量为12 倍和8 倍。

图3 提取影响因素考察结果

提取时间：以有机酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率为指标考察。按处方比例称取饮片100 g，置烧杯中，加水12 倍，浸泡90 min，分别提取30，60，90，120 min，提取2 次，依法测定有机酸含量、苦杏仁苷含量及浸膏得率。结果见图3 C。可见，提取时间为30 ～90 min 时，各指标呈上升趋势，超过90 min 后下降，故选提取时间为90 min 和30 min。

提取次数：以有机酸、苦杏仁苷的含量和浸膏得率为指标考察。按处方比例称取饮片100 g，置烧杯中，加水12 倍，浸泡90 min，提取90 min，分别提取1，2，3 次，依法测定有机酸含量、苦杏仁苷含量及浸膏得率。结果见图3 D。可见，提取次数为1 ～3 次时，各指标呈上升趋势，故选提取次数为3 次和1 次。

提取温度：提取方法为煎煮提取法，根据生产经验，提取温度为100 ℃和90 ℃进行试验。

2.8 Plackett-Burman 试验设计筛选关键工艺参数

试验设计：采用Plackett -Burman 试验设计方法，根据检测指标筛选显著影响的因素［11］。以有机酸的含量、苦杏仁苷的含量和浸膏得率为指标，以浸泡时间（因素A）、加水量（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）、提取温度（因素E）为影响因素。根据单因素试验结果，选择各影响因素水平，采用Plackett-Burman 设计筛选关键工艺参数，因素水平见表1。本试验中采用综合评分作为响应值，采用Mintab 16.0 软件进行分析。

表1 Plackett-Burman 试验因素水平表

试验结果：试验见表2 和表3。由表3 可见，因素B，C，D 有显著影响，因素A，E 无显著影响，故筛选加水量、提取时间和提取次数为关键工艺参数。浸泡时间根据单因素筛选结果选浸泡90 min；根据生产经验，提取加热方式采用先武火后文火。

表2 Plackett-Burman 试验结果

表3 Plackett-Burman 试验方差分析结果

2.9 Box-Behnken 优化提取工艺

根据Plackett-Burman 试验结果，采用Box-Behnken 试验设计［12-14］，以综合评分为响应值［15-18］，优化山参饮提取工艺。试验设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken 试验设计及结果

采用Mintab 16.0 软件，对Box-Behnken 试验数据进行响应面分析，由响应面分析得回归方程Y=98.43-2.29B-0.038C-2.16D-0.58BC+1.28BD-3.52CD-4.89B2-13.21C2-11.66D2，P＜0.01 表明模型拟合度较好。结果见表5，响应面3D 图见图4。可见，优选的最佳工艺为加9.96 倍量水，提取62.47 min，提取2.14 次。依据实际生产情况，修正提取参数为加10 倍量水，提取60 min，提取2 次。

2.10 验证试验

通过以上试验及数据分析，得到山参饮最佳提取工艺条件为加10 倍量水，提取60 min，提取2 次。结合实际操作，将优化后的工艺参数修正为加水量、提取时间、提取次数，重复试验3 次。结果有机酸含量分别为45.52，44.78，45.36 mg/g，平均值为45.22 mg/g；苦杏仁苷含量分别为23.87，23.96，23.51 mg/g，平均值为23.7 mg/g；浸 膏 得 率 分 别 为27.09% ，27.15% ，26.86%，平均值为27.03%。与理论预测值相比，相对误差小于1.0%。表明该方法所建立的数学模型具有良好的预测性，优化工艺条件重复性好。

图4 Box-Behnken 试验响应面3D 图

表5 Box-Behnken 试验方差分析结果

3 讨论

采用鱼骨图列出各因素，筛选主要影响因素，再进行单因素影响试验，根据试验结果确定各影响因素试验水平，采用Plackett-Burman 试验设计筛选显著影响因素，对显著影响因素采用Box -Behnken 试验设计进行优化。最终得到最优提取工艺为加10 倍量水，浸泡90 min，提取2 次，每次60 min，先武火后文火。通过验证，该工艺稳定、可靠。

质量源于设计作为一种先进的国际制剂研究理念，能完成药品质量从检验出来到设计出来的策略要求，采用一系列科学推理和分析方法，达到药品质量批间一致性高的目的。本研究中基于质量源于设计理念优化山参饮提取工艺，可推广到实际生产中，提高提取产物质量的稳定性，保证制剂质量稳定、可控。