镰形棘豆总黄酮灌胃对乙型肝炎大鼠肝损伤的改善作用及其机制

赵兴辉，叶柳凤，林小田

南部战区海军第一医院，广东湛江524000

乙型肝炎(乙肝)是我国常见的传染疾病，由乙型肝炎病毒感染引起，致病率高，病程长，预后差，近年来发病率逐年增高[1，2]。研究[3，4]显示，抑制肝内炎症发生、减缓肝纤维化进程是乙肝临床治疗的关键。镰形棘豆总黄酮是藏药镰形棘豆的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑菌的作用，并可降低纤维化基因的表达，抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化，因而推测镰形棘豆总黄酮可能通过抑制炎症、缓解肝纤维化而对乙肝大鼠发挥保护作用[5，6]。TGF-β1是具有强致纤维化作用的转化因子，可通过促进下游Smad3蛋白磷酸化，进而活化成纤维细胞，促使其合成胶原蛋白，增强纤维化，抑制TGF-β/Smad3信号，进而减轻CCl4诱导的肝纤维化[7，8]。在对骨肉瘤MG63细胞上皮-间质转化的研究[9]中发现，镰形棘豆总黄酮可抑制TGF-β/Smad3通路，因此推测镰形棘豆总黄酮可能通过下调TGF-β/Smad3通路对乙肝大鼠发挥保护作用。2018年10月9日～2019年9月30日，本研究通过建立乙肝大鼠模型，观察镰形棘豆总黄酮灌胃对乙肝大鼠肝损伤的改善作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠、试剂及仪器 SPF清洁级雄性SD大鼠(体质量200～240 g)购自杭州子源实验动物科技有限公司。乙型肝炎病毒抗原(XY-KY-1476)购自上海烜雅生物科技有限公司；镰形棘豆(产自青海)购自青海优润堂商贸有限责任公司，其总黄酮成分(纯度为26.58%)由上海友思生物技术有限公司提取分离；阿昔洛韦购自扬子江药业；乙肝表面抗原(HBsAg)ELISA试剂盒、乙型肝炎E抗原(HBeAg)ELISA试剂盒购自上海冠导生物工程有限公司；兔源GAPDH一抗、兔源纤维连接蛋白(FN)一抗、兔源四型胶原(Col IV)一抗(ab6586)、兔源TGF-β一抗、兔源Smad3一抗、兔源p-Smad3一抗、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。全自动生化分析仪(PUZS-300)购自上海帝博思生物科技有限公司；酶标仪(XElx800)购自美国Perkin Elmer公司；凝胶成像系统(IBright CL 1500)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 乙肝大鼠模型制备、分组、镰形棘豆总黄酮给予方法 参照文献[10]以生理盐水将乙肝病毒稀释为1×106/mL，以10 mL/kg的剂量尾静脉注射SD大鼠，每周注射1次，连续注射3周，然后检测大鼠血清中ALT、AST、HBsAg及HBeAg水平，若均出现明显上升，表明模型建立成功。本研究共建模63只，成功60只，随机分为模型组、镰形棘豆总黄酮低剂量组、镰形棘豆总黄酮中剂量组、镰形棘豆总黄酮高剂量组、阿昔洛韦组，每组12只；另取12只大鼠尾静脉注射等剂量生理盐水，记为对照组。镰形棘豆总黄酮低剂量组、镰形棘豆总黄酮中剂量组、镰形棘豆总黄酮高剂量组分别以70、140、280 mg/kg的镰形棘豆总黄酮溶液[10]进行灌胃处理，阿昔洛韦组以0.2 mg/kg的阿昔洛韦溶液进行灌胃处理，对照组和模型组以等剂量生理盐水灌胃处理。

1.3 各组大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST检测 各组大鼠灌胃24 h后，经尾静脉取血3 mL，静置15 min后离心收集上清，采用ELISA试剂盒检测血清HBsAg、HBeAg水平，采用全自动生化分析仪测定大鼠血清ALT、AST水平，具体操作参照说明书进行。

1.4 各组大鼠肝组织病理形态观察 尾静脉取血后处死大鼠，解剖获得肝组织，剪取约0.5 g储存在-80 ℃冰箱中备用，剩余组织经生理盐水漂洗干净，置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后以石蜡包埋，切片机常规病理切片，脱蜡后置于梯度乙醇中浸泡处理，使用HE试剂盒进行染色，生理盐水漂洗1次，再次经脱水、透明后封片，使用光学显微镜观察肝组织病理形态。

1.5 各组大鼠肝组织纤维化相关蛋白及TGF-β/Smad3通路相关蛋白检测 取大鼠肝组织，剪碎后置于含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液中，在冰浴中匀浆制备为匀浆液，4℃离心后取上清液，获得总蛋白样品液，BCA试剂盒测定各组样品总蛋白浓度，取含相同质量总蛋白的样品液上样，进行电泳，分离蛋白，然后湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，根据目的蛋白分子量截取条带，置于1∶1 000的兔源GAPDH、FN、Col IV、TGF-β、Smad3、p-Smad3一抗溶液中4℃孵育过夜，经TBST漂洗3次后，以1:2 000的羊抗兔二抗溶液室温孵育2 h，再次经TBST漂洗3次后，使用增强化学发光法显色，最后以凝胶成像系统观察蛋白条带并拍照，以Quantity One软件分析图片，得到各目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比较 ①模型组大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平分别为(4 127.26±210.81)IU/mL、(53.72±10.12)IU/mL、(95.21±12.01)U/L、(83.79±11.13)U/L，对照组大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平分别为(2 976.32±130.62)IU/mL、(21.16±5.11)IU/mL、(46.17±8.63)U/L、(48.96±7.01)U/L，两组相比，P均<0.05。②各组大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比较见表1。由表1可知，与模型组相比，镰形棘豆总黄酮低剂量组、镰形棘豆总黄酮中剂量组、镰形棘豆总黄酮高剂量组、阿昔洛韦组大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平均降低(P均<0.05)，且镰形棘豆总黄酮各剂量之间有剂量依赖性(P均<0.05)，镰形棘豆总黄酮高剂量组与阿昔洛韦组差异无统计学意义(P均>0.05)。

表1 各组大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比较

2.2 各组大鼠肝组织病理形态比较 对照组大鼠肝组织结构完整清晰，无病理损伤；模型组大鼠肝组织出现肝小叶结构紊乱，肝细胞变性坏死，数量减少，肝组织局部坏死，有炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生等病理损伤；与模型组相比，镰形棘豆总黄酮低剂量组、镰形棘豆总黄酮中剂量组、镰形棘豆总黄酮高剂量组、阿昔洛韦组大鼠肝组织上述病理损伤减轻，且镰形棘豆总黄酮各组随剂量升高而减轻程度增强，镰形棘豆总黄酮高剂量组与阿昔洛韦组相比，肝组织上述病理损伤减轻程度无明显差异。

2.3 各组大鼠肝组织FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量比较 ①模型组大鼠肝组织FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量分别为1.35±0.23、1.03±0.17、2.12±0.48、0.83±0.12，对照组大鼠肝组织FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量分别为0.13±0.04、0.07±0.02、0.12±0.02、0.06±0.01，两组相比，P均<0.05。②各组大鼠肝组织FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量比较见表2。由表2可知，与模型组相比，镰形棘豆总黄酮低剂量组、镰形棘豆总黄酮中剂量组、镰形棘豆总黄酮高剂量组、阿昔洛韦组大鼠肝组织FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)，且镰形棘豆总黄酮各剂量之间有剂量依赖性(P均<0.05)，镰形棘豆总黄酮高剂量组与阿昔洛韦组差异无统计学意义(P均>0.05)。

表2 各组大鼠肝组织FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量比较

3 讨论

乙肝作为一种传染性疾病，近年来其发病率一直高于其他类型肝炎，是临床研究的热点，具有重大的社会意义[13]。患者感染乙型肝炎病毒后，病毒在体内的复制可引发机体免疫炎症反应，损伤肝细胞，使反映肝功能损伤的指标血清ALT、AST水平升高，并诱导促纤维化因子TGF-β1表达，进而促使成纤维细胞活化、增殖，使肝组织中FN和Col IV蛋白大量合成，造成细胞外基质的沉积，最终导致肝组织炎症损伤及肝纤维化[14]。本研究以乙肝病毒抗原对大鼠进行尾静脉注射，建立乙肝大鼠模型，结果显示，建模大鼠肝组织出现肝小叶结构紊乱、肝细胞变性坏死、数量减少、肝组织局部坏死、有炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生等病理损伤，血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg水平及肝组织FN、Col IV蛋白相对表达量明显升高，表明乙肝病毒抗原可引起大鼠免疫应答，造成肝组织炎症损伤，诱导肝纤维化，损害肝功能，提示模型建立成功。

乙型肝炎病毒引发的肝脏炎症及氧化应激反应是导致肝组织损伤及纤维化的主要病理基础，因而，抗炎、抗氧化是乙肝的有效治疗手段。研究[14]显示，镰形棘豆总黄酮可降低胰岛素抵抗细胞炎症因子表达，减轻炎症，抑制D-半乳糖诱导的急性衰老小鼠肝内氧化应激，延缓TGF-β1引发的人肾小管上皮细胞纤维化[6]，表明镰形棘豆总黄酮具有抗炎、抗氧化及抗纤维化作用。但其对乙肝大鼠是否具有保护作用，目前还未见研究。本研究以镰形棘豆总黄酮处理乙肝大鼠，结果显示，大鼠肝组织病理损伤减轻，血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg水平及肝组织FN、Col IV蛋白表达降低，且镰形棘豆总黄酮各剂量之间呈剂量依赖性，表明镰形棘豆总黄酮可减轻乙肝病毒感染，缓解炎症损伤，降低纤维化相关蛋白表达，抑制肝纤维化，修复肝功能。

TGF-β/Smad3是调控细胞及组织纤维化的关键信号，上调其表达，可活化成纤维细胞，促进其增殖，导致细胞外基质的沉积，进而增强纤维化，抑制TGF-β/Smad3信号激活，降低Smad3的磷酸化水平，可减弱肝星状细胞的活化，缓解TGF-β1诱导的肝纤维化，因而TGF-β/Smad3信号是乙肝的潜在治疗靶点。本研究研究结果显示，TGF-β/Smad3通路在乙肝大鼠体内处于激活状态，而乙肝大鼠经镰形棘豆总黄酮治疗后，其肝组织TGF-β表达增强，Smad3蛋白磷酸化水平升高，临床症状得到改善，表明镰形棘豆总黄酮可能通过下调TGF-β/Smad3通路表达，进而减轻乙肝病毒感染，缓解肝内炎症损伤及纤维化，增强肝功能。

综上所述，镰形棘豆总黄酮可能通过下调TGF-β/Smad3通路蛋白表达，缓解大鼠乙肝病毒的感染，减轻肝内炎症及肝组织损伤，延缓肝纤维化，促进肝功能恢复，对乙肝大鼠具有一定保护作用。但本研究未以该通路抑制剂和激动剂进行对照验证，且对其上下游信号分子也未进行充分探讨，后期将深入进行相关研究。