银杏活脑胶囊高效液相色谱指纹图谱研究*

覃鸿恩，漆立军，徐元翠，夏永芳，彭磊，黄华斌

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院药剂科，恩施 445000)

银杏活脑胶囊是根据我院神经内科名老中医的经验方自主研制的中药复方制剂，由银杏叶提取物、刺五加、制首乌及三七四味中药组成。具有活血散瘀、益气健脑、补肾安神、改善脑供血、增强免疫等功能。主要用于神经衰弱、脑动脉硬化、脑震荡、高血脂等的作用显著，疗效确切，且在我院相关专科使用较广泛，作为我院产业化拳头产品之一，给医院和社会带来显著的效益[1-4]。银杏活脑胶囊主要有效成分有紫丁香苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚、芦丁、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及大黄素等化学成分，这些主要成分对治疗心脑血管疾病有一定的药理作用[5-8]。目前，该制剂质量控制标准较低，且有关该制剂的质量控制标准及主要成分的基础研究鲜有报道[9-10]，为了全面控制制剂质量，保证临床用药质量及效果，并为以后的深入研究提供参考，本实验对银杏活脑胶囊进行高效液相色谱指纹图谱研究[11]。

1 材料

1.1仪器 Shimadu LC20A高效液相色谱仪(LC-20AD四元泵，SPD-M20A检测器，SIL-20A进样器日本岛津公司)，YOKO-2X紫外线分析仪(武汉药科新技术开发公司)，KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，CPA225D电子天平(德国赛多利斯，感量为0.01mg)，HHS-2S型电子恒温不锈钢水浴锅(上海宝蓝实验仪器制造有限公司)。

1.2试药 槲皮素对照品(批号：00081-201408，含量：99.1%)，山李酚对照品(批号：110861-201310，含量：93.2%)，异鼠李素对照品(批号：110860-201410，含量：99.9%)，紫丁香苷对照品(批号：111574-200603，含量：96.4%)，大黄素对照品(批号：0922-201506，含量：99%)，芦丁对照品(批号：1008-201601，含量：98%)，均购于中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rb1对照品(批号：160106，含量：98%)，三七皂苷R1对照品(批号：160520，含量：98%)，均购于北京万佳首化生物科技有限公司；人参皂苷Rg1对照品(批号：15121303，含量：98%，购于河南省标物生物科技有限公司)。

银杏活脑胶囊(本院制剂室自制，批准文号：鄂药制字Z20180310，批号：2018005，2018025，2018069，2018105，2018141，2019029)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本岛津公司)；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：25～30 ℃；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，见表1所示。

表1 流动相梯度洗脱

2.2供试品的制备 按照处方比例，取刺五加全量，制首乌0.7倍处方量加水煎煮，煎煮两次，第一次加水10倍量，煎煮2 h，第二次加水8倍量，煎煮1.5 h，合并两次煎煮液，滤过，滤液浓缩至浸膏(相对密度1.20～1.35)，备用；取剩余制首乌、三七干燥，粉粹成细粉，与银杏叶提取物混匀，备用；上述浸膏与药粉混合后制成颗粒，装入胶囊，即得。同法制得4批银杏活脑胶囊，即20180801，20180814，20180821，20180825。

分别取以上4批银杏活脑胶囊内容物约0.5 g置于10 mL量瓶，加入甲醇定容至刻度，超声提取15 min，滤过，粗滤，经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试样品溶液，每批取3个平行样品。

2.3对照品溶液的制备 分别精密称取紫丁香苷、大黄素、芦丁、槲皮素、异鼠李素、山奈酚、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1，分别制成每毫升甲醇中含有以上对照品0.23，0.33，0.28，0.37，0.17，0.49，0.40，0.3，0.22 mg的溶液，冷藏，备用。

2.4混合对照品溶液的制备 精密称取紫丁香苷对照品2.88 mg、大黄素对照品3.12 mg、芦丁对照品1.78 mg、槲皮素对照品3.05 mg、异鼠李素对照品2.38 mg、山奈酚对照品2.42 mg、人参皂苷Rg1对照品3.75 mg、人参皂苷Rb1对照品3.20 mg及三七皂苷R1对照品2.89 mg，混合置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，溶解完全，备用。

2.4方法学考察

2.4.1精密度考察 取“2.2”项下同批次(批号：20180801)银杏活脑胶囊供试溶液，按照“2.1”项下色谱条件，连续进样6次测定，记录色谱图。以重复性和分离度均较好的31号峰大黄素为参照峰S，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算二者RSD，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.001%～0.034%，相对峰面积的RSD为0.010%～0.161%，表明该仪器精密度良好。

2.4.2稳定性考察 取“2.2”项下同批次(批号：20180801)银杏活脑胶囊供试溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别于制样后0，2，4，8，12 h，吸取该供试品溶液10 μL，进样，测定，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算二者RSD，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.003%～0.050%，相对峰面积的RSD为0.014%～0.108%，表明该方法稳定性良好。

2.4.3重复性考察 取银杏活脑胶囊(批号：2018105)样品，按照“2.2”项下方法制备6份供试品，并依据“2.1”项下色谱条件进样，测定，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，计算RSD，结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.004%～0.026%，相对峰面积的RSD为0.019%～0.133%，表明该方法重复性良好。

2.5指纹图谱的建立及主要色谱峰的化学指认 取6批银杏活脑胶囊样品(批号：2018005，2018025，2018069，2018105，2018141，2019029)，分别按照“2.2”项下方法制备，按照“2.1”项下色谱条件，分别进样，得到银杏活脑胶囊的HPLC指纹图谱，根据相对保留时间和相对峰面积的比对，标记共有峰为33个，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，计算RSD，结果见表2和表3。在相同的色谱条件下，测定对照品和混合对照品的特征指纹图谱，并与银杏活脑胶囊样品指纹图谱进行比对分析，最终确定9个特征共有峰的归属，见图1。

表2 6批银杏活脑胶囊指纹图谱相对保留时间结果

表3 6批银杏活脑胶囊指纹图谱相对峰面积结果

2.6银杏活脑胶囊HPLC指纹图谱相似度评价 将“2.5”项下的6批银杏活脑胶囊样品的指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012 A版)进行相似度评价分析[12]，色谱峰自动匹配后，生成对照指纹图谱，见图2。以样品4作为对照指纹图谱，以其他样品指纹图谱作为对比，进行匹配，采用平均值法得到对照HPLC指纹图谱，通过匹配分析后得到33个共有峰，即为银杏活脑胶囊的共有指纹峰，并以31号特征峰(化学指认为大黄素)作为参照，设其保留时间和峰面积均为1，自动匹配，计算得到6批银杏活脑胶囊样品指纹图谱与对照图谱的相似度，其结果依次为0.897，0.894，0.933，0.925，0.916，0.940。6批不同批次银杏活脑胶囊样品指纹图谱相似度均在0.894～0.940之间，说明银杏活脑胶囊各批次之间相似度较好，质量稳定性较好。结果见表4。

表4 6批银杏活脑胶囊指纹图谱相似度结果

S1.供试品；S2.混合对照品；1.紫丁香苷；2.芦丁；3.槲皮素；4.山奈酚；5.异鼠李素；6.人参皂苷Rb1；7.人参皂苷Rg1；8.三七皂苷R1；9.大黄素。

图2 6批银杏活脑胶囊供试品指纹图谱及对照图谱

3 讨论

3.1供试品的制备 一方面，为了保证临床疗效，方中重要药材三七、银杏叶提取物及0.3倍处方量的制首乌均以原粉入药，其余用水煎煮，通过提取工艺优化后，确定以两次水煎煮最佳；另一方面，因该方已经被申报为院内制剂，正在被批量生产用于临床，实验工艺应与生产工艺同步，从而降低制剂与实验样品的质量差异，使本次研究结果更能直观地反映制剂质量。在制备样品溶液时，考察了1%，2%，3%，5%，6%，8%的不同浓度，考察了甲醇、水、乙醇等不同溶剂，同时考察了不同提取方法，综合考虑，最终确定最佳方法为浓度为5%，甲醇作为溶剂，超声15 min。

3.2流动相的选择 本次研究考察的流动相有甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液，乙腈-水作为流动相时，峰型尖细修长，但是由于乙腈洗脱能力强，导致峰聚集，分离度较差，不利于相似度的分析；甲醇-水作为流动相时，峰型较差，时有肩峰出现，洗脱效果稍差；甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相时，峰型最佳，肩峰较少，分离度较好。故最终确定以甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱作为本次指纹图谱研究的最佳流动相系统。同时，考察了0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL·min-1的流速条件，最终确定以流速为1.0 mL·min-1最为合适。由于成分较复杂，所产生的峰较多，故采用0～120 min内梯度洗脱，各峰分离效果较好，分布较均匀。

3.3波长的选择 通过查阅文献[13-17]，并且通过实验，表明紫丁香苷的最大吸收波长是265 nm，大黄素的最大吸收波长为254 nm，芦丁在257 nm处有最大吸收，槲皮素、山奈酚和异鼠李素的最佳吸收波长是360 nm，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的最佳吸收波长是203 nm。本实验采用全波长扫描，通过3D色谱工作站进行分析，初步判断吸收较好的波长范围在230～275 nm之间。选择230，254，275 nm再进一步进行分析比较，当波长为230 nm时，色谱图中峰较少，分布不均匀，有部分拖尾峰出现；当波长为275 nm时，色谱图出峰较晚，峰形差，杂质峰较多，分离度差；当检测波长为254 nm时，色谱峰分离较好，峰形较好，且能够较多的检测到峰，因此确定以254 nm作为最佳检测波长。

3.4进样量和柱温的考察 分别考察了2，4，6，8，10，12 μL的进样量，比较各进样量下的色谱图，进样量为10 μL的色谱峰，比较稳定，杂质峰较少，因此采用的进样量为10 μL；同时，考察了色谱柱温度对色谱峰的影响，当柱温在25～30 ℃范围内，色谱峰峰形较好，稳定性较好，故将柱温确定在25～30 ℃之间为最佳。

3.5色谱峰的归属及相似度分析 本研究采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”将银杏活脑胶囊的供试品HPLC图谱与混合对照品HPLC图谱进行比较，初步确认出9个峰的化学归属，并将这9个峰进行药材归属分析，其中，1号峰紫丁香苷主要来自刺五加，2号峰芦丁、3号峰槲皮素、4号峰山奈酚和5号峰异鼠李素主要来自银杏叶提取物，6号峰人参皂苷Rb1，7号峰人参皂苷Rg1，8号峰三七皂苷R1主要在三七药材中显著突出，9号峰大黄素来自于制何首乌。所建立的HPLC指纹图谱，通过确认和分析，产生共有峰33个，说明不同批次有较多的相近的组成成分，可以说明该生产工艺和制备方法具有较高的稳定性和成分保留率高。在对6个不同批次的指纹图谱进行相似度分析时发现，有两批样品的相似度稍低(<0.900)，其他4批样品的相似度均高于0.900，说明该产品的质量比较稳定，差异较小，质量一致性好。

综上所述，该指纹图谱能够表达出银杏活脑胶囊的所有原药材的主要成分，而这些主要成分也是银杏活脑胶囊发挥药效的关键，因此通过本次研究得到的银杏活脑胶囊HPLC指纹图谱，可作为银杏活脑胶囊质量控制的指标之一。本次HPLC指纹图谱的研究也为未来银杏活脑胶囊的进一步研究提供基础，有助于推动银杏活脑胶囊的临床评价研究，促使该药品得到更广泛的应用。