依托考昔对大鼠绝经后骨质疏松性骨折愈合的影响

王一寒，张云辉，李亘，张超，董宇启

1 上海交通大学医学院附属仁济医院南院，上海201112；2 上海市宝山区中西医结合医院3 上海交通大学医学院附属仁济医院

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微结构破坏、骨脆性增加和易发生骨折为特征的全身性疾病，是绝经后妇女的常见病、多发病。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重的后果，能够使患者日常生活活动和自理能力下降，甚至丧失独立生活能力[1，2]。据报道，2010年我国发生骨质疏松性骨折患者约233万例，至2050年，骨质疏松性骨折患者将达到599万例[3]。因此，骨质疏松性骨折不仅是一个公共健康问题，还是一个重要的社会问题。COX-2抑制剂是骨折围手术期镇痛的常用药物。有研究报道，COX-2抑制剂能够使骨折愈合延迟[4，5]。但也有研究认为，COX-2抑制剂并不影响骨折愈合[6，7]。依托考昔是一种高选择性COX-2抑制剂，用于骨科围手术期具有良好的镇痛效果[8]，其对骨折愈合影响的研究结论不尽相同[9，10]，但鲜见其对骨质疏松性骨折愈合影响的报道。为此，2014年3月～2015年4月，本研究建立了绝经后骨质疏松性骨折大鼠模型，并观察了依托考昔对骨质疏松性骨折愈合的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠36只，清洁级，7月龄，体质量200～250 g，购自复旦大学医学院实验动物科学部，动物许可证号：SYXK(沪)2014-0029。独立通风笼具饲养，每笼4只。饲养条件：温度(25±3)℃，湿度(40±3)%，光照12 h明暗交替，自由摄食、饮水。依托考昔，购自杭州默沙东制药有限公司。万能材料力学实验机，购自日本岛津株式会社；荧光倒置显微镜，购自日本尼康株式会社。

1.2 绝经后骨质疏松性骨折模型构建 所有SD大鼠适应性喂养1周，进食、饮水自如，活动正常，无脱毛、断尾、死亡等现象，逐一称量体质量，3%戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉满意后，经腹正中切口行双侧卵巢去势手术[11]；常规饲养3个月后，再次逐一称量体质量，3%戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉满意后，按文献[12]方法，于股骨中段做一约2 cm纵行切口，逐层剥离，充分暴露股骨，使用摆动锯片配合骨刀造成横行骨折，然后用1.2 mm克氏针顺行髓内固定，确定骨折端固定稳定和髋、膝关节活动不受限，关闭切口。

1.3 动物分组与药物干预 所有大鼠内固定术后适应性喂养1周，进食、饮水自如，无脱毛、断尾、死亡等现象，将大鼠随机分为长期用药组、短期用药组、对照组，每组12只。依托考昔应用于人骨折围手术期镇痛的常用剂量为60 mg/d[13]，将依托考昔(每片60 mg)研磨成粉末，用生理盐水配制成1.1 mg/mL溶液，根据《药理实验方法学》按人和动物体表面积折算的等效剂量，设定给药剂量。长期用药组每天依托考昔溶液5.4 mg/kg灌胃1次，连续6周；短期用药组每天依托考昔溶液5.4 mg/kg灌胃1次，连续灌胃1周后，等容量生理盐水连续灌胃5周；对照组每天等容量生理盐水连续灌胃6周。

1.4 组织形态学观察 内固定术后1、2、4周，各组随机取3只，断颈处死，取双侧股骨骨折端骨痂组织，-80 ℃保存。待组织成批后，10%中性甲醛固定48 h，100 g/L EDTA-2Na(pH=7.2)脱钙，每周更换1次，直至脱钙满意。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，纵向石蜡包埋，4 μm厚切片，常规HE染色，中性树胶封固，荧光倒置显微镜下拍照。

1.5 生物力学检测 内固定术后6周，断颈处死剩余大鼠，取出双侧股骨，去除克氏针，利用万能材料力学实验机，采用三点弯曲法检测股骨骨折愈合处最大载荷和弹性载荷。

2 结果

2.1 各组股骨骨折端骨痂组织形态学观察 内固定术后1周，对照组可见丰富的纤维组织且排列整齐，并可见散在软骨骨痂形成，而短期用药组和长期用药组可见大量纤维组织，但密度较低且分布不均匀。内固定术后2周，对照组骨小梁开始形成，软骨骨痂大量增生；短期用药组可见骨小梁形成且连续，但密度分布不均匀，软骨细胞增多；长期用药组以纤维骨痂为主，可见散在骨小梁，连续性差，软骨骨痂稀疏。内固定术后4周，对照组可见大量排列整齐的骨小梁，基本完成软骨骨痂的骨转化过程；短期用药组骨小梁表现接近对照组，长期用药组骨小梁粗细不均且排列紊乱，间隙较宽，可见大量软骨骨痂。

2.2 各组股骨骨折愈合处最大载荷、弹性载荷比较 长期用药组有1只体型消瘦、毛发稀疏、活动减弱，对照组有1只左侧大腿发生感染肿胀，均剔除实验，再次造模补充。各组股骨骨折愈合处最大载荷、弹性载荷比较见表1。

表1 各组股骨骨折愈合处最大载荷、弹性载荷比较

3 讨论

随着人口老龄化加剧，我国骨质疏松症的患病率明显增加。目前，我国骨质疏松症患者约有9 000万，至2050年将达到2亿。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重的后果，患者往往伴随疼痛、抑郁、活动恐惧等，具有较高的致残率和致死率[14，15]。骨质疏松性骨折多发生于绝经后妇女，并且骨折愈合时间较长，骨不连风险较高。因此，探索绝经后妇女骨质疏松性骨折的相关治疗具有重要意义。

COX-2抑制剂能够通过选择性抑制COX-2表达来抑制前列腺素合成，从而达到抗炎、镇痛等作用，其胃肠道不良反应较传统非甾体抗炎药明显减少，是骨科围手术期镇痛的常用药物[16]。依托考昔是一种高选择性COX-2抑制剂，2002年首先在英国上市，2008年在中国正式上市。国内最早用依托考昔治疗急性痛风性关节炎、滑囊炎等，近年开始用于骨科围手术期镇痛治疗[8]，具有较好的镇痛效果且鲜有胃肠道不良反应[17]。Moreschi等[9]研究表明，依托考昔能够延迟新西兰雄兔自体颅骨的愈合过程，但对最终移植骨愈合无明显影响；陈海涛等[10]研究发现，依托考昔能够抑制新西兰兔桡骨骨折的愈合过程。但国内外鲜见依托考昔对绝经后骨质疏松性骨折愈合影响的报道。

本研究通过双侧卵巢去势手术建立大鼠骨质疏松症模型，该模型能够模拟绝经后妇女骨质疏松的病理过程，其病理生理特征与人类接近[18]，然后按照Xu等[12]方法制备股骨骨折模型，并观察依托考昔治疗不同时间股骨骨折端骨痂组织形态学变化和骨折愈合处最大载荷、弹性载荷。结果发现，内固定术后1周，对照组可见丰富的纤维组织且排列整齐，并可见散在软骨骨痂形成，而短期用药组和长期用药组可见大量纤维组织，但密度较低且分布不均匀，提示内固定术后1周内依托考昔对纤维组织生成的抑制作用不明显，对软骨骨痂生成的抑制作用明显。内固定术后2周，对照组骨小梁开始形成，软骨骨痂大量生成；短期用药组可见骨小梁形成且连续，但密度分布不均匀，软骨细胞增多；长期用药组以纤维骨痂为主，可见散在的骨小梁，连续性差，软骨骨痂稀疏，提示连续应用依托考昔2周能够明显抑制骨质疏松性骨折愈合。内固定术后4周，对照组可见大量排列整齐的骨小梁，基本完成软骨骨痂的骨转化过程，短期用药组骨小梁表现接近对照组，长期用药组骨小梁粗细不均匀且排列紊乱，间隙较宽，可见大量软骨骨痂，提示连续应用依托考昔4周能够抑制骨性愈合速度和质量，延长愈合时间，但其抑制骨折愈合的作用是可逆的，早期停药后骨折愈合可恢复到正常水平。骨生物力学特征是评价骨折愈合程度的重要依据。本研究通过万能材料力学实验机，采用三点弯曲法检测股骨骨折愈合处最大载荷和弹性载荷，结果发现，内固定术后6周，长期用药组股骨骨折愈合处最大载荷、弹性载荷均低于对照组和短期用药组，而对照组与短期用药组比较差异均无统计学意义，提示依托考昔能够降低骨质疏松性骨折的骨性愈合强度，而早期停药对骨性愈合强度的影响不大。

综上所述，长期应用依托考昔能够延迟和抑制大鼠绝经后骨质疏松性骨折愈合，并能使骨折愈合强度降低，而短期应用对骨折愈合的影响不大。