益生菌改善尿毒症大鼠肠道氧化应激反应保护肠道屏障功能的研究

魏萌 蒋红利 史珂慧 王萌 孙凌霜 何荃

710061 西安，西安交通大学第一附属医院血液净化科

慢性肾脏病患者由于肾小球滤过率持续降低，大量的尿毒症毒素如尿素、尿酸、胺类、胍类、吲哚类、未完全代谢的激素等在体内潴留，血液中多种代谢废物不断蓄积，患者逐渐产生尿毒症的各种症状，以胃肠道症状尤为突出[1]。本课题组前期研究发现，尿毒症患者存在严重肠道屏障功能障碍，尿毒症大鼠出现肠道细菌移位且肠道通透性增高[2-3]，肠道菌群移位参与尿毒症微炎症状态的产生和发展，而微炎症与多种尿毒症并发症密切相关[4-5]。益生菌具有改善肠道屏障完整性，抑制病原菌黏附定植，调节肠道免疫力等多种有益作用[6]。动物双岐杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)是目前研究较多、应用较广泛的益生菌菌种，多个实验研究均发现其具有调节肠道屏障功能的卓越效果[7-8]。因此，本研究拟通过对尿毒症大鼠口服补充益生菌动物双岐杆菌乳亚种Bi-07，研究益生菌是否可改善尿毒症大鼠肠道屏障功能障碍，并同时探讨益生菌对肠道氧化应激反应的作用，以期揭示补充益生菌改善肠道屏障功能的作用机制，为后续深入研究益生菌干预改善尿毒症患者多种并发症提供理论依据。

材料与方法

一、尿毒症动物模型制备及实验分组

取雄性SD大鼠40只，随机分为假手术组(n=10)以及模型组(n=30)，模型组采用5/6肾切除法制备尿毒症动物模型，假手术组仅打开肾包膜。至第10周末，模型组有20只大鼠达到尿毒症肾功能水平，进入后续实验，分为尿毒症组(n=10)和尿毒症+益生菌组(n=10)。将动物双歧杆菌乳亚种Bi-07冻干粉接种至改良TPY培养基复苏后，取少量菌液再次接种至TPY培养基37 ℃培养16 h，调整菌液浓度至109Cfu/mL。取菌液1 mL灌胃尿毒症+益生菌组大鼠，灌胃后给予正常饮水及饮食，每日灌胃，共持续4周。假手术组和尿毒症组大鼠均行普通饮水饮食处理。

二、肾脏及肠道组织病理学

三组大鼠采用水合氯醛麻醉后，分别取空肠、回肠、结肠肠道组织标本按常规脱水、透明、包埋，石蜡切片3～4 μm。按组别进行苏木素-伊红染色(HE染色)。

三、肠道通透性的检测

每只大鼠均给予含有5 μCi/mL的99mTc-DTPA溶液1 mL灌胃后，置于代谢笼中，以新的清洁塑料杯收集每只大鼠24 h尿液。24 h后测定每只大鼠的尿量，取少量尿液用于检测尿中所含的核素量。同时采用断尾法留取大鼠血液用于测定残留在血液中的核素浓度。通过估算每只大鼠的血液量换算出残留在其体内的核素量。核素的检测在西安交通大学医学院第一附属医院核医学科进行，检测过程由其临检人员执行。肠道的通透性以24 h尿液中所含的99mTc-DTPA总量及残留在血液中的核素量之和占灌胃给予的99mTc-DTPA量的百分比表示，计算公式如下：

大鼠总血量(mL)=0.06×体质量(g)+0.77[9]

放射剂量(血)=核素浓度×总血量(mL)

放射剂量(尿)=核素浓度×总尿量(mL)

四、免疫比浊法检测超敏C反应蛋白

采用散射免疫比浊法测定血清超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)。检测操作委托西安交通大学医院第一附属医院检验科。检测严格按照hs-CRP试剂盒说明操作。

五、血清中炎症因子白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α水平检测

所有样品血清均进行酶联免疫吸附试验检测白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。检测过程严格按照试剂盒说明书进行。

六、硝酸镧示踪法观察肠上皮细胞间紧密连接超微结构

各组随机选取5只大鼠，分别留取回肠组织标本0.5 cm，生理盐水充分漂洗去除黏附的肠道内容物。迅速将标本置入3%硝酸镧-0.1 mol/L二甲胂酸钠-3%戊二醛的固定液中，固定2 h。取出标本，于3%硝酸镧-0.1 mol/L二甲胂酸钠的缓冲液漂洗2次，每次10 min。再经含2%硝酸斓-1%四氧化锇固定液作后固定2 h，0.1 mol/L二甲胂酸钠的缓冲液浸洗后，常规电镜梯度丙酮或乙醇脱水，Epon812包埋。超薄切片机切片，每份标本在透射电镜下随机观察5个视野。

七、肠组织丙二醛含量及超氧化物歧化酶活力检测

将冻存于-80 ℃的回肠组织取出，称重后置入4 ℃生理盐水中匀浆。以1 500 rpm离心15 min，取上清。匀浆液蛋白定量采用考马氏亮兰蛋白法。采用硫代巴比妥酸缩合法测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，MDA测试盒由南京建成生物公司提供，检测步骤严格按说明书进行。采取黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力，SOD测试盒由南京建成生物公司提供，检测步骤严格按说明书进行。

八、统计学处理

结 果

一、各组大鼠一般情况及生化指标比较

术后三组大鼠伤口无出血和感染。尿毒症组大鼠逐渐表现出活动量减少、对外界刺激反应迟钝，喜拱背蜷缩，食物摄入量减少，且体质量增长速度减缓，毛色转黄干枯，疏松不齐，眼、耳、尾逐渐变苍白。假手术组活动灵活，毛色、眼、耳及尾部均无异常变化，食量随体质量增长不断增加，尿量无异常改变。尿毒症+益生菌组大鼠基本情况同尿毒症组。

术后7天模型组大鼠出现蛋白尿，尿素氮、血肌酐水平逐渐升高，术后第10周，5/6肾切除建模大鼠共有20只存活且血肌酐水平达到尿毒症标准。假手术组10只大鼠全部存活。尿毒症组、尿毒症+益生菌组大鼠红细胞比容均显著低于假手术组(P<0.05)，尿毒症组大鼠尿量有减少趋势，但与假手术组相比无统计学差异(P>0.05)。(表1)

表1 三组大鼠基本生物学参数

二、光镜下各组大鼠肠道病理情况比较

假手术组大鼠各肠段呈正常肠组织形态，肠绒毛结构清晰饱满，炎性细胞数量较少且分布均匀，绒毛部肠上皮细胞间可见大量吸收细胞。

尿毒症组空肠、回肠明显可见肠绒毛萎缩变细、倒塌，固有层大量炎性细胞浸润，吸收细胞减少，空肠、回肠固有层及黏膜下层可见局部水肿，部分肠黏膜见浅表的溃疡形成。结肠亦见炎性细胞浸润，但与假手术组相比差异较小。

尿毒症+益生菌组空肠、回肠仍可见炎细胞浸润，但炎细胞浸润程度较尿毒症组减轻，空肠、回肠固有层及黏膜下层可见局部水肿，几乎不可见肠黏膜浅表溃疡。结肠亦见炎性细胞浸润，但与假手术组差异较小。(图1)

图1 三组大鼠空肠、回肠、结肠病理图(HE染色) A.假手术组空肠(×100)；B.假手术组回肠(×200)；C.假手术组结肠(×100)；D.尿毒症组空肠(×100)；E.尿毒症组回肠(×200)；F.尿毒症组结肠(×100)；G.尿毒症+益生菌组空肠(×100)；H.尿毒症+益生菌组回肠(×200)；I.尿毒症+益生菌组结肠(×100)

三、各组大鼠肠道通透性比较

尿毒症组肠道通透性显著高于假手术组(P<0.05)；与尿毒症组相比较，尿毒症+益生菌组肠道通透性显著降低(P<0.05)；尿毒症+益生菌组与假手术组相比较，肠道通透性无显著差异(P>0.05)。(表2)

四、各组大鼠炎症介质水平比较

尿毒症组hs-CRP、IL-6、TNF-α水平显著高于假手术组(P<0.05)；与尿毒症组相比较，尿毒症+益生菌组hs-CRP、IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.05)；尿毒症+益生菌组与假手术组相比，hs-CRP、IL-6、TNF-α水平无显著差异(P>0.05)。(表2)

表2 三组大鼠血炎症介质、内毒素及肠道通透性

五、电镜下各组大鼠肠道病理情况比较

假手术组回肠上皮细胞微绒毛表面少见镧颗粒附着，肠黏膜上皮细胞间紧密连结构完整，未见高电子致密物硝酸镧渗入。

尿毒症组回肠上皮细胞微绒毛表面附着大量镧颗粒，高电子致密物硝酸镧清晰分隔所有细胞外膜，不仅上皮细胞间紧密连接破坏可容硝酸镧渗入，细胞之间所有接触部位均有大量硝酸镧渗入。

尿毒症+益生菌组回肠上皮细胞微绒毛表面有少量镧颗粒附着，可见少量示踪剂渗入细胞间隙，极少部分细胞间隙呈高电子密度影，细胞间紧密连接结构模糊。尽管硝酸镧可通过连接复合体，但是并未见硝酸镧下行渗入深面细胞膜。(图2)

注：箭头示硝酸镧染料聚集

六、各组大鼠肠组织MDA含量及SOD活力比较

回肠组织MDA含量及SOD活力反映组织氧化损伤程度。结果显示：与假手术组相比，尿毒症组回肠组织中MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD活力显著降低(P<0.05)。与尿毒症相比较，尿毒症+益生菌组SOD活力显著升高(P<0.05)，与假手术组相比较，尿毒症+益生菌组SOD活力无显著差异(P>0.05)。与尿毒症组相比较，尿毒症+益生菌组MDA含量降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。(表3)

表3 三组大鼠肠组织SOD活力及MDA含量

讨 论

本研究中我们对尿毒症大鼠补充益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07，并从肠道通透性、血炎症因子、肠道氧化应激水平以及肠道超微结构多个方面研究益生菌对尿毒症肠屏障的保护作用，结果显示尿毒症大鼠补充益生菌后，肠上皮细胞间紧密连接完整性恢复，肠道通透性下降、肠道氧化应激减轻，血中炎症因子水平改善，提示补充益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07可改善肠道屏障功能，其机理与降低肠道氧化应激反应关系密切，并能够在一定程度上改善尿毒症微炎症状态。

正常情况下，肠道正常菌群之间保持着相当稳定的比例关系，它们与肠道黏膜结合，以黏附或嵌合的方式形成有一定规律的膜菌群，与宿主的微空间结构形成一个既相互依赖又相互作用的微生态系统，这种微生态系统构成了肠道的微生物屏障。在构成肠道生物屏障的众多细菌中，双歧杆菌属和乳杆菌属是主要的共生菌类，其中双歧杆菌和乳酸杆菌被认为是人类宿主最重要的有益菌[10]。我们前期研究发现终末期肾病患者及大鼠肠道菌群谱发生了改变，乳酸杆菌、双歧杆菌及拟杆菌门等益生菌减少，梭状芽胞杆菌、肠杆菌科、产气荚膜梭菌等致病菌增多[2-3]。肠道菌群谱的改变使得肠道细菌产生的代谢产物发生改变，也使得肠道来源的尿毒症毒素谱发生改变。

益生菌是指“对机体健康产生有益影响的微生物”。目前，益生菌在炎症性肠病[11]、肝硬化[12]、肠易激综合征[13]、抗生素相关性腹泻[14]等疾病的治疗中发挥着重要作用，主要作用机制包括维持肠道屏障完整性，调节肠道局部免疫力，保持正常菌群结构，降低病原体对肠道附着力并抑制其繁殖。研究证明尿毒症患者及动物较常出现肠道黏膜局部水肿糜烂、肠道运动功能障碍、肠道局部及全身免疫力低下，肠道黏膜屏障损害普遍存在[15]。因此，针对性的给予尿毒症大鼠补充其明确缺乏的益生菌，可能起到稳定肠道屏障功能的作用。

益生菌摄入机体后，其自身或表面成分作为抗原物质刺激机体免疫。肠道内树突状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等抗原递呈细胞对其水解、消化、加工，继之与Th细胞相互作用，最终激活肠道固有层内B淋巴细胞。在益生菌的不断刺激下，B淋巴细胞分化增强，大量的成熟浆细胞可分泌sIgA、IgG、IgM。益生菌能够对肠黏膜中免疫细胞刺激、诱导分化，而免疫细胞充分发挥其摄取、抗原呈递的作用，故产生大量的免疫效应因子，抵抗外源性致病菌对机体损害，进而保护肠道的免疫屏障。

肠上皮细胞间紧密连接结构在维持肠黏膜的通透性和完整性方面起着重要作用，是构成肠黏膜机械屏障的重要组成部分。硝酸镧是一种高密度的重金属，分子量为433，其颗粒大小约为1～4 nm，不能穿过正常的细胞间紧密连接和细胞膜，故其常用于判断组织细胞间是否存在紧密连接、屏障功能及细胞膜通透性改变，是超微结构水平常用的示踪物[16]。硝酸镧染色结合透射电镜方法观察紧密连接其结果直观反映肠道机械屏障完整性。本研究采用硝酸镧示踪剂染色观察肠上皮细胞间紧密连接，发现尿毒症组大鼠的肠黏膜细胞间紧密连接间隙明显增宽，示踪剂有不同程度的渗透现象。在尿毒症+益生菌组大鼠肠组织中示踪剂渗透减少，提示益生菌干预可改善肠上皮细胞间紧密连接完整性，保护肠道的机械屏障功能。

MDA是脂质过氧化反应最终代谢产物，反映了机体脂质过氧化的速度和强度，SOD是体内主要的自由基清除剂，保护机体组织和细胞DNA免受氧化损伤。本研究发现：尿毒症大鼠肠道组织MDA含量增加，SOD活性降低，表明尿毒症大鼠肠道过氧化反应增强，大量的氧自由基可能参与肠道屏障功能损伤。脂质过氧化作用可引起细胞损伤及功能障碍，大量的氧自由基能攻击生物膜中的多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并形成过氧化产物。尿毒症时SOD等抗氧化酶减少，使机体不能有效清除脂质过氧化物产物。脂质过氧化反应产生大量的氧自由基，脂质双层在氧自由基的作用下膜表面糖蛋白结构含量出现改变，脂质双层细胞膜结构生理性稳态异常。另外，脂质过氧化反应损伤细胞内多种酶活性，如三磷酸腺苷酶、碱性磷酸酶和核苷酸酶结构异常，三磷酸腺苷生成减少使得细胞膜主动转运功能障碍[17-18]。因此我们推测肠道中过氧化反应增强可能与肠道屏障功能障碍有关。本项目在对尿毒症大鼠补充益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07后，结果显示肠组织中SOD活力显著增强，MDA呈下降趋势，说明补充益生菌后肠道氧化应激反应减弱，提示益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07保护肠道屏障完整性的机理为抑制氧化应激反应。动物双歧杆菌不表达尿素酶基因，因此可避免尿素衍生的胺类和细菌尿素酶催化的氨对肠屏障的破坏作用。

本项目补充益生菌后大鼠血液中IL-6、TNF-α、hs-CRP等微炎症指标也显著改善，提示益生菌可改善尿毒症大鼠微炎症反应。增加有益菌数量，可减少潜在致病菌数量，可以竞争性的阻止病原菌黏附定植在肠黏膜。双歧杆菌通过维持肠上皮细胞间紧密连接的蛋白表达，维持肠屏障的完整性[19]，能够调节非特异性细胞免疫反应，增加粒细胞和单核细胞的吞噬活力，移位的细菌因此可以被俘获和清除[20]。

综上所述，尿毒症大鼠补充益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07保护肠道屏障功能，可减轻尿毒症微炎症状态，其机理与降低肠道氧化应激反应关系密切，然而在尿毒症状态下，益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07改善肠道屏障功能的分子机制还值得进一步探讨。