不同甘蔗品种根际土壤酶活性及微生物群落多样性分析

农泽梅 史国英 曾泉 叶雪莲 秦华东 胡春锦

摘  要：通過桶栽试验，比较了8个甘蔗品种吸氮效率的差异以及不同品种根际土壤酶活性和微生物群落多样性的差异，以期为甘蔗生产上的选种以及蔗地土壤生产力的维持提供科学支持。在甘蔗大生长期末期收集甘蔗植株和根际土壤，比较不同品种甘蔗植株的吸氮效率和氮肥利用率、测定根际土壤蔗糖酶以及脲酶活性、利用Miseq高通量测序技术对甘蔗根际细菌群落多样性进行分析。研究结果表明，不同甘蔗品种在大生长期末期的吸氮效率存在一定差异，8个品种的植株平均吸氮效率为17.95%～27.57%，氮肥利用率为22.15%～34.02%，其中吸氮效率及氮肥利用率最高的品种是‘桂糖44号，最低的是‘桂选B9;8个品种的根际土壤蔗糖酶活性3.51～6.56 mg/（g·d），脲酶活性1.12～ 1.42 mg/（g·d），不同品种间存在一定差异，土壤酶活性表现较高的品种为‘桂糖48号和‘新台糖22号，而‘粤糖93159的土壤酶活相对较低。高通量测序分析结果显示，8个不同品种甘蔗根际土壤细菌种群结构存在一定差异，不同品种间在优势菌群组成上差异不显著，主要差异表现在优势菌属的丰度上，其中‘桂糖44号和‘粤糖93159均以Bacillus为最主要的优势菌属，而其他6个品种的主要优势菌属均为Chryseolinea。冗余分析结果显示，甘蔗氮吸收率、土壤碱解氮含量以及土壤pH对土壤微生物群落结构的影响最大;相关性分析表明，不同甘蔗品种吸氮效率的差异以及部分土壤理化指标均与根际土壤微生物群落中不同优势菌门存在一定的相关性;根系微生物菌群结构的差异可能在一定程度上影响了甘蔗的吸氮效率。本研究结果初步揭示了不同甘蔗品种氮肥利用率与根际微生物群落结构的相关关系，为深入研究甘蔗根际微生物多样性及功能与环境因子之间的关系提供了借鉴。

关键词：甘蔗;根际土壤;土壤酶活;微生物群落多样性

中图分类号：S154      文献标识码：A

Abstract： In order to provide scientific support for the selection of sugarcane production and the maintenance of sugarcane soil productivity， the differences in nitrogen uptake efficiency of eight sugarcane varieties and the effects of different varieties on the enzyme activities and microbial community diversity in the rhizosphere soil were compared through the barrel cultivation experiment. Sugarcane plants and rhizosphere soils were collected at the end of large growth stage of sugarcane， and nitrogen utilization efficiency， invertase and urease activities in the rhizosphere soil of different sugarcane varieties were measured and compared. Meanwhile， the bacterial community structure of the sugarcane rhizosphere soil was determined and analyzed by the Miseq high-throughput sequencing technology. The nitrogen uptake efficiency of different sugarcane varieties was different. The average nitrogen uptake efficiency of the eight varieties was 17.95%27.57%， and the nitrogen use efficiency was 22.15%34.02%. The highest nitrogen uptake efficiency was for GT44， and the lowest was for B9. The invertase activity of the rhizosphere soil was 3.516.56 mg/（g·d）， and there were significant differences among different cultivars. But the urease activity was 1.121.42 mg/（g·d）， and there was few differences among different varieties. GT48 and ROC22 were the two varieties with higher soil enzyme activity in the rhizosphere. The results of high-throughput sequencing showed that there were some differences in the bacterial population structure in the rhizosphere soil of the eight sugarcane varieties， but there was no significant difference among different varieties in the composition of the dominant bacteria， and the main difference was in the abundance of the dominant genera. Bacillus was the dominant genus for GT44 and Y93159， while Chryseolinea was the dominant genus for the other six varieties. Redundancy analysis （RDA） showed that the nitrogen absorption efficiency of sugarcane， the content of available N and pH value of soil had the greatest effect on the soil microbial community structure. Correlation analysis showed that the nitrogen absorption efficiency of sugarcane and soil physiochemical characteristics were significantly correlated with different dominant microbial communities. This study would deepen the understanding of the microbial community in the sugarcane rhizosphere and provide references for the relation between the microbial composition and diversity with environmental factors.

Keywords： sugarcane; rhizosphere soil; soil enzyme activity; microbial community diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.025

根际是植物根系与土壤交界的微域，是植物-土壤-微生物及其环境相互作用的一个特殊界面[1]。土壤酶与土壤微生物以及作物3者之间的关系是当前土壤微生态研究的热点问题[2-3]。分析和比较不同作物的根际微生态特性，包括土壤酶活性以及微生物菌群结构，可为从微生态学角度挖掘作物的低肥高效栽培潜力提供理论依据。

甘蔗（Saccharum officinarum）是世界上最重要的糖料和能源作物。我国是产蔗大国，其中广西是中国最大的蔗糖生产区，甘蔗和蔗糖产量占全国的60% 以上[4]。然而，由于我国甘蔗主产区的主要耕作土壤类型为红壤土或赤红壤土，具有pH低、养分含量低、硝化与反硝化活性低等特点，甘蔗生产上一直面临着产量过于依赖化学肥料投入的困境，产业缺乏国际竞争力;同时，大部分老蔗区还面临着甘蔗品种退化、土地肥力下降的现状。近年来，相关科研工作者已就甘蔗生产上的“肥药双减”问题，从不同角度开展了大量研究[5]。李文宝[6]和杨荣仲等[7]对不同氮水平条件下不同甘蔗品种材料的产量、耐低氮胁迫能力等进行了比较，发现不同品种间存在显著差异。但是，由于甘蔗遗传背景比较复杂，目前关于甘蔗氮素高效利用机制的研究进展比较缓慢。近年来，植物根际微生物区系与土壤可持续生产力的关系等相关研究受到越来越多的关注[8-9];对作物根际微域的研究，可以挖掘具有潜力的微生物资源、探究植物病害发生的机制[10]。不同作物、或者同一作物不同品种间的差异也可通过根际土壤酶活性和土壤微生物多样性的差异表现出来，如具有不同抗逆性或抗病性存在差异的品种间的根际土壤微生物群落结构也存在明显的差异[11-16]。目前关于甘蔗根际土壤微生态区系的研究，多集中在不同栽培模式下对甘蔗的影响。前人研究表明，间、套种等种植模式可改善宿根蔗的土壤生态环境，而单一的宿根甘蔗连作容易导致其根际土壤总微生物量及酶活性下降，从而导致甘蔗产量下降，而宿根蔗套种大豆对其根际土壤微生物区系具有明显的改善作用，从而使宿根蔗具有明显的产量优势[17-20]。然而，关于不同甘蔗品种间根系微生态区系的差异，特别是氮效率不同的甘蔗品种间的根际微生物群落结构及土壤酶活性的差异等，目前尚无系统的研究报道。本研究拟通过分析和比较不同甘蔗品种吸氮效率的差异及其对根际土壤酶活性和微生物群落多样性的影响，以期为甘蔗生产上的选种以及蔗地土壤生产力的维持提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料与试验设计

试验于2018年在广西壮族自治区农业科学院试验地进行，供试土壤为广西甘蔗产区的典型红壤土，为减少土壤的粘性，方便取甘蔗的根际土壤进行分析，向红壤土中混合了一定比例的菌糠作为甘蔗栽培土。将混合后的土壤分装于甘蔗栽培桶内，每桶15 kg。混合栽培土的pH 6.89，速效氮含量为228.2 mg/kg。

供试甘蔗品种为：‘新台糖22号（ROC22）、‘粤糖93159（Y93159）、‘桂选B8（B8）、‘桂选B9（B9）、‘桂糖42号（GT42）、‘桂糖44号（GT44）、‘桂糖46号（GT46）、‘桂糖48号（GT48）。甘蔗采用种茎单芽育苗，选取生长基本一致的甘蔗幼苗进行移栽，每桶种3个单株，每品种种植4桶，甘蔗桶栽后摆放于试验地中，自然条件下生长。

甘蔗于2018年4月初移栽，6月初施肥1次，参照大田管理施肥用量，每桶施复合肥54 g，尿素14 g，氯化钾15 g，进行穴施，同时每桶培土5 kg;于9月上旬在甘蔗伸长期末期对甘蔗植株进行整株采收同时采集根际土壤用于实验分析。因此，甘蔗每桶栽培土壤的重量固定为20 kg，栽培土速效氮含量为228.220=4546 mg，约4.55 g;根据相关比例测算结果每桶施肥含氮量为19.46 g。

1.2  方法

1.2.1  甘蔗植株及根际土样的收集与处理  去除每桶甘蔗表层5 cm的浮土，然后将整桶土壤拍散并取出完整的甘蔗植株，将根系上的土壤抖落回栽培桶的中，植株解析成根、茎、叶，分别清洗干净并晾干后进行称量、用切割机切碎并混合均匀，根据测定指标需要取一定量烘干后粉碎，用于甘蔗植株氮素含量的测定。根据下式计算各处理甘蔗的氮素吸收效率以及氮素的相对利用率：

植株氮素累积量=植株干物重氮素含量

氮素吸收效率=[植株氮素累积总量/土壤的速效N（肥料N+土壤N）]100%

氮肥利用率=（植株N累积总量/肥料N）100%

由于取样时甘蔗的根系已经遍布整个栽培桶，故此除去表层土的整个栽培桶的土壤均作为根际土壤，每桶土样混合均匀后，过1 mm筛，按拟分析指标的需要分装到无菌封口袋中保存备用。土样分别用于根际细菌种群多样性分析、土壤pH、土壤总N、速效N含量和土壤酶活性测定等。

1.2.2  土壤pH和氮素含量测定  土壤风干后用于pH和土壤氮素含量测定，参考《土壤农业化学分析方法》[21]，其中土壤总氮含量测定采用凯氏定氮法，土壤速效氮含量测定采用碱解扩散法，土壤pH测定采用电位测定法，水壤质量比2.5∶1。

1.2.3  土壤脲酶及蔗糖酶活性測定  土壤样本风干后用于土壤酶活性的测定，其中土壤脲酶活性采用苯酚钠比色法[22]测定，土壤蔗糖酶活性用3，5-二硝基水杨酸比色法[23]测定。

1.2.4  根际细菌群落多样性测定  收集后的新鲜根际土壤保存于?80℃冰箱，提取土壤微生物DNA，经检测合格后用于构建文库，以各土壤样品微生物总DNA为模板，以细菌V3+V4区特异引物（338F/806R）进行PCR扩增，采用Illumina MiSeq测序平台对PCR产物进行双端测序分析，委托上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。细菌种群多样性则通过在美吉生物i-sanger云平台上提供的测序结果进行个性化分析。

Bacillus、Chryseolinea、Paenibacillus、Lysin?iba?c?i??llus、Truepera、Variibacter、Mesorhizobium和Brevi?bacillus等。根据以上菌属在不同样品中的OTU数量建立柱状图（图4），结果显示，GT44和Y93159均以Bacillus为最主要的优势菌属，而3类芽孢菌Paenibacillus、Lysinibacillus、Breviba?cillus也是这2个品种根际细菌中的最主要菌属之一;而其他6个品种的最优势菌属均为Chryseolinea。

2.5  甘蔗根际土壤细菌群落的主要影响因子分析

为明确甘蔗的氮吸收率和土壤理化性质（土壤氮素和碱解氮含量、土壤pH以及土壤脲酶和蔗糖酶活性对土壤细菌群落的影响，在细菌门分类水平上对土壤微生物群落进行冗余分析（RDA），结果见图5。RDA分析的前2个轴总共解释了87.79% 的群落变化，第1个轴解释了71.81%，第2个轴解释了15.98%。甘蔗氮吸收率对土壤微生物群落的影响最显著，其次是土壤碱解氮含量;6个不同影响因子总共解释了92.41% 的群落变化，影响的顺序为甘蔗氮吸收率>土壤碱解氮含量>土壤pH值>土壤脲酶活性>土壤氮素含量>土壤蔗糖酶活性。

进一步分析了6个不同环境因子与土壤微生物群落的关系，对土壤细菌群落中的优势菌群（门水平）和環境因子进行相关分析，相关性Heatmap见图6。结果表明，仅甘蔗氮吸收率、土壤碱解氮含量和pH与部分优势菌群[绿弯菌门（Chlo?ro?f?l?e?xi）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）酸杆菌门（Acidobacteria）]存在显著或极显著相关性，其他4个优势菌群（Proteobacteria、Bacteroi??detes、Gemma?timon?a?detes和Deinococcus-Thermus）与相关环境影响因子的相关性均未达显著水平。

3  讨论

3.1  不同甘蔗品种的氮效率以及根际土壤部分理化性质的差异

本研究分析了8个甘蔗品种在大生长期末期的氮肥利用率以及根际土壤部分理化性质的差异，结果表明，不同甘蔗品种的氮肥利用率存在一定差异，其中有2个甘蔗品种GT42和GT44的氮肥利用率大于30%，氮肥利用率最低的是B9，为22.15%;所有甘蔗品种根际土壤的pH均较种植前提高，品种间存在一定的差异;甘蔗采收以后不同处理间的土壤氮素、碱解氮含量以及土壤酶活性亦表现出一定的差异。分析结果显示，甘蔗的氮肥利用率与反映土壤理化性质的多个土壤环境因子之间未表现出显著的相关性，却一定程度上证明了不同甘蔗品种对根际土壤微生态的影响是有差异的。由于甘蔗的生长周期较长，本研究仅分析了甘蔗伸长期末期这一个时间点的相关信息。由于不同品种的生长特性可能存在一定差异，因此，本研究结果未能全面反映品种间真实的差异。但是，由于伸长期毕竟是甘蔗生长一个最重要的时期，也是氮肥需求量最高的一个时期。因此，本研究结果是具有一定的代表性和参考意义的。

3.2  甘蔗根际土壤微生物群落结构的特征

基于高通量测序的分析结果表明，不同甘蔗品种根系微生物的丰富度指数和多样性指数均存在一定的差异，但不同处理间主要菌群种类基本相似，其主要差异表现在菌群的丰度上。在门分类水平以及菌属水平上，不同处理间优势菌属的OUT数量都存在显著差异。如不同甘蔗品种的根系微生物中都含以下8种已明确分类的菌属：Bacillus、Chryseolinea、Paenibacillus、Lysini?ba?ci?llus、Truepera、Variibacter、Mesorhizobium和Bre?vi?bacillus，但以上优势菌属在不同甘蔗根系土壤样本中的OTU数量差别较大。甘蔗品种GT44和Y93159均以Bacillus为最主要的优势菌属，另外3种芽孢杆菌Paenibacillus、Lysinibacillus以及Brevibacillus也是这2个品种根际细菌中的最主要菌属之一，而其他6个品种的最优势菌属均为Chryseolinea。上述多种芽孢杆菌属细菌的相关种群已被研究证明为许多动植物的益生菌，并已在生产上大量应用[24-26];而Chryseolinea菌属为一类近年发现的菌群，据目前相关研究报道该菌属细菌可能主要与生物降解相关[27-28]。因为不同菌群生物学和生态学功能上的差异，甘蔗根系微生物优势菌群丰度的差异可能会最终影响根系土壤微域的生态学功能，从而影响不同品种的吸氮特性并导致品种间氮肥利用率的差异。

3.3  甘蔗根际土壤微生物群落结构与环境因子的关系。

甘蔗根际土壤微生物群落与甘蔗氮素吸收率和部分土壤理化因子的冗余分析表明，不同品种甘蔗的氮吸收率对微生物群落的影响最显著，其次是土壤碱解氮含量和pH，其他理化因子如土壤酶活性等对土壤微生物群落结构均有重要的影响，说明土壤微生物群落结构与土壤环境关系密切。前人研究表明，植物种类对土壤微生物群落结构有重要影响，相关研究表明，植株根系分泌物对根际微生物群落结构组成具有选择塑造作用，不同植物的根际微生物群落结构具有独特性和代表性[7-9]。由于本研究中所有供试甘蔗品种在栽培管理上保持一致，尽可能地减少了处理间土壤环境因子的差异。因此，引起甘蔗品种根际微生物区系差异的主要因子是由品种间的差异，而品种间的差异也导致了根际土壤理化性质的差异。

4  结论

8个不同甘蔗品种大生长期的吸氮效率及其氮肥利用率存在一定差异，品种间的差异也表现在根系土壤酶活以及根系微生物区系上，不同品种间根系微生物主要菌群丰度存在显著差异。甘蔗氮效率与根际微生物群落结构存在一定的相关性;同时，由于不同菌群生物学和生态学功能上的差异，根系微生物优势菌群丰度的差异可能在一定程度上影响了甘蔗的吸氮效率。从本研究结果来看，甘蔗品种GT44的根系微生物菌群组成或许更适合植株的生长和土壤肥力的维持，其氮肥利用率也是8个供试甘蔗品种中最高的，为34.02%。在今后研究工作中，将持续跟踪不同甘蔗品种在各生育时期的生长特性及其根系微域的变化，同时对甘蔗根际微生物研究将重点放在分析参与氮循环相关微生物菌群的丰度上，并将进一步分析甘蔗品种的宿根性表现，拟为建立一套从根际微域环境的差异筛选适合蔗地土壤生产力维护的氮高效甘蔗品种的技术方法提供理论依据。

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