杭白菊对肾损伤小鼠的干预效果及可能作用机制▲

梁育汝 王彩冰 罗红叶 唐 敏 陈由阳 屠兴荣

(右江民族医学院临床医学院,广西百色市 533000,电子邮箱：1278106161@qq.com)

杭白菊为菊科植物菊的干燥头状花序,是常用的中草药及生活饮品,具有清热解毒、平肝明目、散风清热的功效[1]。有文献报告,杭白菊具有护心保肝、抑菌抗炎、抗氧化、防衰老等作用[2-6],但鲜见有关杭白菊对肾损伤改善作用的研究报告。故本研究通过腹腔注射四氯化碳建立小鼠肾损伤模型[7],探讨杭白菊对肾损伤小鼠的干预效果及其作用机制,为杭白菊的开发和利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级健康KM小鼠50只,约5周龄,体重(25±2)g,雌雄各半,由右江民族医学院动物实验中心提供(使用许可证号：SYXK桂2017-0004；生产许可证号：SCXK桂2017-0003)。分笼饲养,自由进食和饮水,室温 25℃左右。

1.2 药品、试剂及器械 杭白菊(康美药业股份有限公司,批号：170550751)；四氯化碳(成都市科龙化工试剂厂,批号：20130329)；0.9%氯化钠注射液(广西裕源药业有限公司,批号：L16062904)；甲醛(烟台市双双化工有限公司,批号：20170701)。白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)酶联免疫吸附检测试剂盒、血清尿素氮测试盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测试盒、丙二醛测试盒均购自南京建成生物工程研究所(批号：20180106、20180105、20180103、20180104)。电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司,型号：JM-B1003)；多功能酶标仪(上壹桥国际贸易有限公司,型号：Tristar Lb941)；可见分光光度计(上海精科实业有限公司,型号：722型)；离心机(上海安亭科学仪器厂,型号：TGL-16G)；手持、台式两用均质器(美国PRO Scientific公司,型号：PR0200)；三用恒温水箱(金坛市医疗仪器厂,型号：HH-W600)；数码显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司,型号：BA210Digital)。

1.3 杭白菊提取液的制备 取杭白菊干品300 g,用2 000 mL 的30℃蒸馏水浸泡30 min,文火煮沸2 h,过滤后将滤液用文火隔水浓缩至500 mL(相当于生药600 mg/mL),冷却后放入4℃冰箱保存备用,用时以双蒸水配成所需浓度的杭白菊提取液。

1.4 动物分组与给药方法 动物适应性饲养1周,按体重随机分为对照组、模型组以及杭白菊低、中、高浓度组,每组10只。除对照组外,其余4组按10 mL/kg腹腔注射0.1%四氯化碳建立小鼠肾损伤模型,对照组腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液,连续5周,实验第1周时,1次/d,第2周至第5周隔天注射1次。同时，杭白菊低、中、高浓度组按10 mL/kg给予小鼠灌胃杭白菊提取液，给药浓度分别为150、300、600 mg/mL,对照组和模型组给予灌胃等量0.9%氯化钠注射液,实验第1周时,1次/d(注射四氯化碳后灌胃),第2周至第5周隔天灌胃1次,给药时间与四氯化碳注射日隔开,实验第6周时改为1次/d,实验持续6周。在末次用药灌胃后检测相关指标。

1.5 血清IL-6、尿素氮水平、SOD活性、丙二醛水平的检测 末次灌胃前禁食12 h、禁水2 h,末次灌胃30 min后采用摘除眼球法采血1 mL放入试管中,血标本静置5 h后以3 500 r/min离心10 min分离血清,采用酶联免疫吸附检测试剂盒检测IL-6水平，采用尿素氮测试盒检测血清尿素氮水平,采用SOD测试盒、丙二醛测试盒分别检测血清SOD活性、丙二醛水平。所有操作严格按照说明书进行。

1.6 肾组织SOD活性、丙二醛水平的检测 采血后迅速剖腹取肾脏,取左肾组织加冰冻0.9%氯化钠注射液搅拌制成10%肾组织悬液,以3 000 r/min离心10 min分离上清液,分别采用SOD测试盒、丙二醛测试盒检测肾组织SOD活性、丙二醛水平。所有操作严格按照说明书进行。

1.7 肾组织形态学观察 将小鼠右肾浸泡于10%甲醛溶液固定30 min后，依次行脱水、石蜡包埋、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,通过数码显微镜观察各组小鼠肾脏的组织结构并摄像。

1.8 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 5组小鼠血清尿素氮、IL-6水平比较 5组小鼠血清IL-6、尿素氮水平比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。除杭白菊高浓度组外,其余3组血清IL-6水平均高于对照组,杭白菊高浓度组血清IL-6水平低于模型组(均P<0.05)。模型组血清尿素氮水平高于其余4组(均P<0.05),但各浓度杭白菊组与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 5组小鼠血清尿素氮和IL-6水平比较(x±s)

2.2 5组小鼠肾组织和血清SOD活性、丙二醛水平比较 模型组肾组织和血清SOD活性均低于其余4组(P<0.05),杭白菊高浓度组血清SOD活性均高于对照组和杭白菊中浓度组(P<0.05)；4组血清丙二醛水平均高于对照组,但各浓度杭白菊组血清丙二醛水平低于模型组,高浓度组低于低浓度组(P<0.05)。见表2。

表2 5组小鼠肾组织和血清SOD活性、丙二醛水平比较(x±s)

2.3 肾组织病理检查结果 对照组小鼠肾小体和肾小管的结构和形态完整、清晰,肾小球占肾小体体积的1/3～1/2,肾小囊和肾小管组织透明且无沉积物。模型组小鼠肾小体、肾小管组织大面积变性坏死，结构模糊、损坏严重,肾小球疏松、血管破坏、体积增大,约占肾小体体积的1/2～2/3,肾小囊和肾小管上皮细胞变性坏死、管腔变小、腔内普遍有嗜复红物和细胞碎片,肾组织内有大量白细胞浸润。杭白菊低、中、高浓度组小鼠肾小体、肾小管组织可见不同程度的损坏，结构模糊,肾小球疏松、血管破坏、体积增大,肾小囊和肾小管上皮细胞可见变性坏死，腔内有嗜复红物和细胞碎片,肾组织内有白细胞浸润,但这些病变均轻于模型组,并随杭白菊浓度的增加而改善。见图1。

对照组 模型组 杭白菊低浓度组 杭白菊中浓度组 杭白菊高浓度组

3 讨 论

肾脏是人体主要的排泄器官,其排泄总类最多、排泄量大,可以排出机体的代谢终产物以及进入机体的过剩物质、异物、毒素、药物等,并可调节机体的水、电解质和酸碱平衡,对机体的内环境稳态起着至关重要的作用[8]。四氯化碳经血液吸收促使机体生成自由基CCl3·和CCl3O2·,这些自由基攻击细胞膜,致使细胞膜磷脂过氧化而生成脂质过氧化物,从而破坏组织细胞,因此其常被用于诱导动物肾损伤,建立肾损伤动物模型[7,9-10]。SOD是抗氧化酶,它通过清除机体超氧自由基避免细胞膜脂质过氧化，从而维持细胞膜的完整性,而机体自由基生成过多或清除能力降低可引起细胞损坏。丙二醛是脂质过氧化物的中间代谢产物,其含量可反映脂质过氧化物浓度[11]。尿素氮是蛋白质代谢的终末产物,其经肾小球滤过随尿排出,当肾实质受损害时,肾小球滤过率降低,致使血尿素氮浓度增加,目前临床上常通过测定尿素氮水平,判断肾小球的滤过功能[12]。IL-6是一种炎症因子,肾系膜细胞异常增殖可引起大量的IL-6释放，从而刺激肾脏发生炎症反应，并造成肾功能损害[13-15]。本研究采用四氯化碳诱导小鼠肾损伤,结果显示,与对照组比较,模型组的血清尿素氮及IL-6升高,说明肾小球滤过功能下降,肾实质受损,炎症因子可能参与肾损伤的过程；同时,模型组肾组织和血清SOD活性均降低,血清丙二醛升高(P<0.05),即肾组织发生脂质过氧化反应,且SOD消耗过多,提示自由基参与四氯化碳诱导肾损伤过程。肾组织病理学检查也显示,模型组肾小管的结构和形态普遍变性坏死,肾组织内有大量白细胞浸润。以上结果均表明本研究成功建造小鼠肾损伤模型。

杭白菊有清热解毒之功效[1],还具有护心保肝、抑菌抗炎、抗氧化、防衰老等作用[2-6],是我国民间日常生活饮用品。本研究结果显示,杭白菊低、中、高浓度组小鼠的肾小体、肾小管的结构和形态可见不同程度的损坏,肾组织内有白细胞浸润,但这些病变均轻于模型组,提示杭白菊可减轻四氯化碳造成的肾组织结构破坏。杭白菊各浓度组血清尿素氮低于模型组(P<0.05),且与对照组差异无统计学意义(P>0.05),说明杭白菊可改善四氯化碳导致的小鼠肾小球滤过功能下降,从而发挥肾功能保护作用。模型组及杭白菊低、中浓度组血清IL-6水平高于对照组,但杭白菊高浓度组血清IL-6水平低于模型组(均P<0.05),说明高浓度杭白菊能降低IL-6水平,减轻四氯化碳诱发的炎症反应。模型组肾组织和血清SOD活性低于对照组，而血清丙二醛水平均高于对照组(P<0.05)；而各浓度杭白菊组肾组织和血清SOD活性均高于模型组，且血清丙二醛水平均低于模型组(均P<0.05)；杭白菊高浓度组血清SOD活性高于杭白菊中浓度组，血清丙二醇水平低于杭白菊低浓度组(均P<0.05)。说明一定剂量的杭白菊(尤其是高浓度)可提高肾损伤小鼠肾组织SOD活性,提高机体清除自由基能力，并可降低肾损伤小鼠肾组织细胞的脂质过氧化，对肾细胞膜有一定保护作用。

综上所述,杭白菊对四氯化碳诱导的小鼠肾损伤具有改善作用,且高浓度(600 mg/mL)时效果更佳，其机制可能与杭白菊可减少炎症因子生成、提高机体清除自由基能力有关。