低温胁迫下13份地被菊品种耐寒性筛选

全英杰， 蔡永亮， 岳圆圆， 任镘蓉， 高 日*

(1.延边大学农学院；2.延边林业绿化有限公司:吉林 延吉 133002)

温度是限制植物分布的重要因素，低温条件下，植物不能正常生长发育，严重时甚至致死。植物在受到低温胁迫后，可以通过改变生理条件来提高耐寒性[1]。植物受到低温胁迫时，活性氧(ROS)和自由基含量增加，损伤膜系统，破坏细胞空间结构，使自身代谢平衡紊乱[2]。植物在逆境条件下，其体内通过一系列的生化反应来降低受到的伤害[3]。超氧化物歧化酶是一种可以消除生物体新陈代谢过程中产生的有害物质的重要保护酶[4]。低温胁迫时，植物体内SOD含量上升，将自由基还原成水和氧分子，清除植物内活性氧，维持代谢平衡[5]。黎瑞珍等[6]研究发现，在逆境条件下，植物能产生SOD清除O2-产生的毒害，提高耐寒性。过氧化物酶是一类广泛存在于植物体内用来清除逆境下细胞产生的活性氧自由基的酶，可抑制过氧化反应，维持细胞膜的稳定性和完整性[7]，从而减轻逆境带来的伤害[8]。伍宝朵等[9]研究发现，胡椒会通过提高抗氧化酶来抵御低温伤害。丙二醛的含量可以间接衡量植物的耐寒性，杜鑫宇等通过测定不同烟草品种苗期MDA含量研究持续低温胁迫下烟草耐寒性生理指标[10]。

膜系统是植物受低温胁迫的关键结构，低温胁迫下可通过植物细胞电解质渗出的多少间接了解植物受伤的程度[11]。在自由基的影响下，细胞不饱和酸发生质膜过氧化生成丙二醛，产生毒性增大膜透性，使其流动性减弱，因此，丙二醛的量可以反映细胞膜损伤的程度，逆境伤害时其含量会增加[12]，可以根据其含量的变化表现植物的耐寒能力。

地被菊(ChaysanthemummorifoliumRamat.Tzve)为菊科菊属多年生草本植物，是中国传统花卉之一，植株矮小，花型紧凑，品种较多，花色有红色、黄色和粉色等，花期8～10月份[13]，被广泛应用于广场、公园、街道以及各类园林绿地中。地被菊对环境的适应能力强，广泛分布在华南、华中和华北等地区，由于环境条件的限制，仅有少部分品种可以在东北地区栽培，目前地被菊“金陵”、“钟山”和“雨花”等品种已在辽宁地区成功引种[14]，而在延边地区适合栽培地被菊品种未见报道。因此，该试验以13个地被菊品种叶片为材料，通过测定半致死温度，对耐寒性进行评价，同时在5 ℃与20 ℃条件下对4个高耐寒品种的SOD和POD酶活性，MDA含量进行比较，以期筛选出适宜在延边地区生长的地被菊品种，为研究菊花耐寒性机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从南京农业大学菊花种质资源库引进“锦灵之风”、“锦灵千寻”、“锦灵靛翠”、“锦灵柔柳”、“锦灵柔骄”、“映洁玉桂”、“映洁月桂”、“映洁樱桂”、“映洁紫骄”、“映洁紫寇”、“靖山赤骄”和辽宁引进的“映洁红菲”和“靖山紫花”共13个地被菊品种，在延边大学农学院教学基地中分别扦插繁殖。

1.2 方法

1.2.1 相对电导率的测定

不同品种的地被菊长到15 cm高时，在不同温度下处理2 h，处理温度分别为15、10、5、0和-5 ℃，取顶部叶片5枚用于试验材料。将处理后的叶片剪成边长为1 cm的小方块，用电子天平称取1 g左右放入装有20 mL去离子水的试管中，静置2 h后用电导率仪(DDS 307型)测定初电导值C1，然后在沸水中煮沸15 min，冷却静置后测定终电导值C2，得到相对电导率，为C1/C2×100%[15]。以电导率值和相应处理温度拟合Logistic回归方程 y=k/(1+ae-bx)。依据方程得到参数a、b,根据 LT50=-lna/b求出半致死温度(LT50)[16]。式中,y为相对电导率,x为处理温度/℃，a、b为方程参数，k为曲线渐近线，即细胞最大电解质透出率(a、b、k>0)。

1.2.2 POD和SOD酶活性、MDA含量测定

将地被菊“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”、“靖山紫花”进行扦插，待幼苗长到15 cm高，含有6～8片叶子后进行低温处理，温度设定为5和20 ℃，处理时间为2 h，每个处理重复3次。低温处理后取顶部的2～3片叶片，测定MDA含量和SOD及POD活性。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法测定[17]，SOD活性采用NBT光还原法测定[17]，POD活性用愈创木酚法测定[17]。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 进行数据处理，利用SPSS 19.0软件T检验进行显著差异性分析(显著水平为0.05)，聚类分析采用K-Means。

2 结果与分析

2.1 不同品种地被菊的半致死温度

地被菊叶片在不同低温下处理后测定其相对电导率值，得到相对电导率，根据拟合的Logistic方程，计算半致死温度(表1)。不同品种地被菊半致死温度为-1.39～-23.49 ℃，半致死温度-20 ℃以下的品种有“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”、“靖山紫花”。其中，“映洁玉桂”半致死温度最低为-23.49 ℃；半致死温度为-5 ℃以上的地被菊品种主要有“锦灵之风”、“锦灵千寻”、“锦灵柔柳和“映洁月桂”。

表1 不同品种地被菊相对电导率回归方程及半致死温度

2.2 不同品种地被菊耐寒性聚类分析

采用K-Means聚类分析法根据半致死温度将13个品种划分为3个等级(表2)，耐寒性强的品种有“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”、“靖山紫花”，其平均半致死温度约为-22.15 ℃。“锦灵靛翠”、“锦灵柔骄”、“映洁紫寇”为第2类耐寒品种，其平均半致死温度为-12.28 ℃。耐寒性较弱的品种有“锦灵之风”、“锦灵千寻”、“锦灵柔柳”、“映洁月桂”、“映洁樱桂”、“靖山赤骄”，其平均半致死温度为-4.19 ℃。

表2 耐寒性聚类分析

2.3 低温条件下高耐寒品种地被菊POD活性变化

低温对高耐寒地被菊品种POD活性有较大的影响，在5 ℃条件下，地被菊“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”、“靖山紫花”POD活性比对照分别提高了2.19倍、2.10倍、2.97倍、1.57倍，并且呈极显著差异(图1)。

图1 低温条件下高耐寒品种地被菊POD活性变化

2.4 低温条件下高耐寒品种地被菊SOD活性变化

高耐寒地被菊低温处理后，SOD活性的变化如图2。其中，“映洁紫骄”，5 ℃时的SOD活性为203.6 U/g.FW，比对照提高了16倍多。“映洁玉桂”、“映洁红菲”、“靖山紫花”5 ℃时的SOD活性也均高于对照处理组，且均呈显著差异性。

图2 低温条件下高耐寒品种地被菊SOD活性变化

2.5 低温条件下高耐寒品种地被菊MDA含量变化

低温处理高耐寒地被菊品种发现，不同品种间MDA含量变化不同(图3)，其中,变化最小的是“靖山紫花”，MDA含量在低温处理时仅上升0.2 U/mg.FW，而“映洁紫骄”，MDA含量在低温处理时上升2.0 U/mg.FW，高耐寒地被菊品种5 ℃处理，MDA含量与对照相比变化不大，有略微升高但均无显著差异。

图3 低温条件下高耐寒品种地被菊MDA含量变化

3 讨论与结论

植物受到低温胁迫后，细胞质膜透性发生变化，通过测定电导率计算半致死温度，可直接反应耐寒性。赵秀梅[18]测定8个桃品种的耐寒性，结果表明，半致死温度与枝条恢复生长验证的结果基本吻合。该试验中“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”、“靖山紫花”半致死温度分别为-23.49、-23.48、-21.00和-20.61 ℃，耐寒性较高。在切花菊中，通过测定半致死温度，筛选出南农金柠檬、Qx097、QD028、Qx049、Qx153和Qx008等6个耐寒性强的品种资源，并且都得到验证[19]。生理指标也能反映植物的抗性，张春兰等通过测定不同基因型大豆SOD和POD活性对耐盐性进行筛选[20]，白冰等通过测定鸡冠花SOD和POD的含量，研究逆境胁迫下鸡冠花的生理变化[21]。当外界低温超过植物自身的临界值，植物体内保护酶(SOD和POD)含量会迅速下降甚至消失，当外界低温在植物自身保护的临界值内，酶能做出反应来减少低温对植物造成的伤害。该试验中“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”和“靖山紫花”POD与SOD酶活性在低温时均显著高于对照。MDA是植物膜质过氧化作用的主要产物之一，在一定温度范围内，低温胁迫程度越大，植物积累的MDA越多。研究发现地被菊MDA含量变化随温度降低而增加，MDA会增大细胞的膜透性，对细胞膜有毒害作用。杨凤翔[22]研究不同品种草莓耐寒性发现，耐寒性弱的品种MDA含量更高。杨捷等[23]研究天目琼花和花叶锦带耐寒发现，MDA含量与耐寒性呈负相关。在低温处理下“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”和“靖山紫花”MDA含量变化都较小，也体现它们的耐寒性较高。该研究中“映洁玉桂”、“映洁紫骄”、“映洁红菲”和“靖山紫花”在低温处理下SOD与POD酶活性都显著增高，且半致死温度都低于-20 ℃，为耐寒性较强的地被菊品种。