“双阴性”T细胞与系统性红斑狼疮

杜孟茹 综述 谢红浪 审校

系统性红斑狼疮(SLE)是临床最常见的自身免疫性疾病，可累及皮肤、关节、血液、肾脏等多个组织及脏器，好发于青年女性，死亡率较高，其发病原因和机制尚未完全阐明。目前认为SLE的组织损伤机制包括自身抗体产生、免疫复合物沉积以及组织中活化的T、B淋巴细胞浸润等[1]。大量研究表明T细胞介导的免疫反应在SLE中发挥着重要的作用。各种T细胞亚群均参与SLE的病理生理、组织损伤和疾病表达[2]。近些年来国内外研究发现，SLE患者的外周血液中TCRαβ+CD3+CD4-CD8-T(简称“双阴性”T细胞，DN-T细胞)细胞数量明显增多，且与SLE的活动相关。研究发现，cAMP响应元件调节子α(CREMα)的过表达可引起DN-T细胞扩增，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活促进DN-T细胞分泌促炎性细胞因子，在SLE致病中发挥作用。本文拟简介DN-T细胞的起源、作用及其在SLE中的可能机制，旨在寻求SLE治疗的新途径。

DN-T细胞

DN-T细胞是免疫系统的重要组成部分，约占外周血中所有CD3+T淋巴细胞的 1%～3%[3]，存在于健康个体的次级淋巴器官中，如人和鼠的肾脏，肠上皮和女性生殖道等[4]。关于DN-T细胞的起源和功能尚不清楚，且存在争议。国内外研究认为DN-T细胞来源于胸腺，或来自外周血中CD4+和(或)CD8+T细胞。

胸腺来源的DN-T细胞在胸腺发育过程中，T细胞通过基因重排产生克隆受体，四种编码基因形成四条聚合链，产生两种不同类型的异源二聚体T细胞受体(TCR):α/β 和 γ/δ，大约95%的T细胞表达TCR α/β,而5%的T细胞表达TCR γ/δ。大部分的TCR α/β T细胞可表达CD4或CD8核心因子，并分别促进他们与MHC Ⅱ类和Ⅰ类分子相结合，然而，一小部分TCR α/β T细胞缺乏CD4和CD8，即所谓的“双阴性”T细胞。目前主要通过TCR转基因小鼠模型研究DN-T细胞[4]。胸腺细胞的发育首先要经历双阴性阶段[5]，之后小鼠通过CD8+未成熟单阳性阶段(ISP)分化为CD4+CD8+双阳性(DP)细胞，最后特异性表达CD4或CD8。DN-T细胞可能在胸腺细胞发育过程中逃避了阴性选择和阳性选择，随后在外周血中活化、扩增[6]。如前所述，TCR的产生依赖于T细胞的基因重排，根据TCR的信号强度以及性激素的诱导释放量[7]，DN胸腺细胞晚期(DN3)也可产生DN-T细胞。另有研究发现在体外培养的胸腺皮质上皮细胞可向DP细胞呈递高亲和力配体，引起免疫调节性TCR α/β+DN-T细胞的分化。Rodríguez等[8]研究表明TCR α/β+DN-T 细胞可能源自CD8+，较少源自CD4+细胞。在接受纯化的CD8+胸腺细胞的小鼠，受TCR介导的刺激后CD8+细胞比CD4+细胞更容易变成DN-T细胞。体内实验证明TCR α/β+DN-T细胞是由成熟、分化的CD8+T细胞，下调CD8辅助受体的表达而形成的；在未接受处理的野生型(WT)小鼠，几乎所有TCR α/β+DN-T细胞都来自胸腺[8]。

表观遗传机制如DNA甲基化、组蛋白修饰等参与胸腺 T 细胞发育过程中 CD8 基因簇的调控。CD4+CD8+和CD8+T 细胞中CD8基因簇的DNA甲基化水平低，可以表达CD8A 和CD8B，而 CD4+和DN-T细胞中CD8A和CD8B基因的DNA 甲基化水平升高则禁止该基因表达[9]。

起源自外周血CD4+和(或)CD8+T细胞有一部分DN-T细胞可源自外周血中的CD4+和(或)CD8+T细胞。Zhang等[10]研究发现在存在白细胞介素12(IL-12)或IL-15的情况下，用同种异体骨髓来源的树突状细胞(DC)刺激 CD4+T细胞，可以从CD4+T细胞中衍生出DN-T细胞。Grishkan等[11]证明在体外慢性(作者定义为超过3周)刺激鼠脾源性CD4+T细胞可导致DN-T细胞生成，并显示出效应子表型。在SLE患者，活化的T细胞中高表达的CREMα可调控CD8A和CD8B 的表达。CD8B启动子(CNS2)的抑制和CREMα的其他增强子的反式表达导致转录沉默和CD8表面表达的下调，从而促进DN-T细胞的生成。来源于健康人的CD8+T细胞亚群在体外TCR复合物刺激下也可转化成DN-T细胞[12]。

SLE患者DN-T细胞增多的机制

SLE患者中大部分DN-T细胞均来自活化的(自反应性)CD8+T细胞。SLE患者的T淋巴细胞显示出一系列复杂的细胞、分子信号异常，其中部分可归因于CREMα表达增加。CREMα属于转录因子超家族，CREM 同源物包括诱导型 cAMP 早期阻遏物(ICER)，cAMP 响应元件结合蛋白1(CREB-1)和CREB-2，以及CREM/激活转录因子1(ATF-1)，ATF-2 和ATF-3。CREMα在SLE患者和狼疮易感(MRL-lpr)小鼠的T细胞中过表达,通过下调CD8表达而产生DN-T细胞。除上文已述的CNS2 反式抑制外，CREMα还可将DNA 甲基转移酶3a(DNMT3a)和组蛋白甲基转移酶G9a募集到人和鼠CD8 簇(CNS2、7 和 8)内的调控区域，指导染色质重塑和转录沉默，从而引起DN-T细胞的扩增[13]。转录因子 Runt 相关转录因子(RUNX)3和 Runx/核心结合因子β是活化的CD8+T细胞募集CD8簇的几种增强子(E8Ⅰ-E8Ⅳ)表达CD8 共受体所必需的[14]。E8I的缺失导致整个CD8 簇的染色质重塑，因为 E8I映射到CNS-6 和-7，并且位置接近 CNS-8，它们均响应TCR激活在CREMα指示下表观遗传重塑[14]。 因此，减少RUNX3募集到该区域也可能在CD8+T细胞向DN-T 细胞转化中发挥作用，这将是未来研究的方向。目前尚不清楚SLE患者T细胞中CREMα水平升高的原因。尽管张庆等[15]研究提示SLE患者CD4+T细胞CREMα启动子区组蛋白去甲基化酶JMJD3增加，这可导致此区域组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)水平下降，从而促使CREMα增多，这一改变可能是引起SLE发病的重要机制之一，但与他们先前的发现SLE患者CD4+T细胞CREMα启动子区H3K4me3的水平明显高于正常对照相反，故此有待进一步的研究。

CREMα还可介导SLE患者的CD4+效应T细胞中前炎症效应细胞因子IL-17 (IL-17A)的增加和 IL-2 的表达缺陷[16]，这是近年来CREMα表观遗传研究的热点，但机制尚不明确。CREMα通过反式抑制及特定DNA和组蛋白甲基转移酶或组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的组织和区域特异性募集使IL-2沉默。相反，CREMα可以激活IL-17A 并介导表观遗传重塑，其胞嘧啶-磷酸-鸟苷DNA基序甲基化(meCpG)减少，组蛋白H3乙酰化增加，作用尚待确定[17]。Ohl 等[18]证明T 细胞中 CREMα的过度表达会导致Fas缺陷(Fas-/-)狼疮样小鼠模型产生大量扩展的DN-T细胞库和产生干扰素γ(IFN-γ)的T细胞，同时Treg细胞的数量降低。MRL/lpr小鼠中IL-2的低、连续水平的系统表达有效抑制了肾脏、肺和皮肤的炎症[19]，反映了IL-2作为治疗靶点的有效性。在T细胞过表达CREM α的 Fas-/-转基因(FVB/Fas-/-CREMαtg)小鼠中，外源性IL-2可以逆转 CREM α 介导的产生IFN-γ细胞的增加和调节性 T 细胞的减少，还发现IL-2 的使用显著降低了IgG 抗体，这可能是由Treg细胞引起的(图1)。但IL-2不能减少DN-T细胞,不能逆转DN-T细胞显著扩增引起的FVB/Fas-/-CREMαtg 小鼠的大量淋巴结肿大和脾肿大，这表明鼠中DN-T细胞的大量扩增是 CREMα过表达的直接作用而不是由这些小鼠中 IL-2水平降低引起的，这也证明了CREMα 在体内DN-T细胞生成中的核心作用。

图1 cAMP响应元件调节子(CREM)α的过表达和雷帕霉素的作用机制CREMα:cAMP响应元件调节子α；mTORC1:雷帕霉素靶蛋白复合体1；DN-T:TCRαβ+CD3+CD4-CD8-T 细胞；Treg:调节性T细胞；IFN-γ:干扰素γ；GATA-3:CATA结合蛋白3;IL：白细胞介素；FoxP3+Tregs：FoxP3+调节性T细胞;红色箭头代表CREMα过表达的作用，蓝色箭头代表IL-2的作用，黄色箭头代表雷帕霉素的作用。CREMα通过下调CD8表达而增加DN-T细胞。CREMα还介导CD4+效应T细胞中 IL-17A 的增加和 IL-2 的表达缺陷。IL-2治疗可以逆转 CREMα 介导的 产生IFN-γ 细胞的增加和调节性 T 细胞的减少，降低IgG 抗体。雷帕霉素阻断mTORC1可抑制DN- T细胞产生IL-4和CD4+T细胞中产生IL-17，同时逆转FoxP3+Tregs的耗竭。雷帕霉素不能抑制CD8+T细胞中IL-4的产生(该作用由GATA-3介导)

DN-T细胞在SLE的致病机制

DN-T细胞是一种罕见的异质性T淋巴细胞亚群。在自身免疫性疾病条件下如SLE，干燥综合征和自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)等，DN-T细胞会大量扩增[8]。狼疮性肾炎(LN)是SLE最常见的并发症。75%的SLE患者在确诊5年内即可表现出LN的临床特征，然而，在SLE诊断5年或更长时间后，几乎100%的无症状患者在活检中都可发现病理损害。DN-T细胞在SLE患者肾脏中浸润，可产生促炎作用的细胞因子，激活其他免疫细胞并诱导自身抗体产生。而某些致炎性细胞因子的产生与DN-T细胞激活雷帕霉素靶蛋白复合体1相关。

致炎作用研究报道DN-T细胞可分泌多种细胞因子，如IFN-γ、IL-17、IL-10等。在体外分离、生成的DN-T细胞均表达一系列促炎效应细胞因子包括IL-1、IL-8和趋化因子(如ICXCL3和CXCL2)[20]。多项研究观察到TCR复合物激活后，DN-T细胞可表达IFN-γ[21]。胡伟等[6]通过实验证明SLE患者体内IFN-γ的含量与DN-T细胞的比例相关。IFN-γ属于一种Th1特异性的促炎细胞因子，但也可增强移植耐受能力。

DN-T细胞可自发地分泌免疫调节因子IL-10。已知IL-10可通过抑制T细胞反应发挥抗炎功能[22]，但其又有助于B细胞的激活、分化和产生抗体[23]。DN-T细胞可表达前炎症效应细胞因子IL-17。但IL-17并不仅出现在DN-T细胞对感染和自身免疫性疾病的反应中，也存在于健康受试者的DN-T细胞中[24]。IL-17是强大的促炎细胞因子，具有诱导炎症和造成组织破坏能力。在LN患者的肾脏活检组织中检出IL-17 和DN-T细胞。以往证据已表明IL-17在LN的发病机制中起作用。除了CD4+T细胞，在SLE患者中检测的IL-17大部分由DN-T细胞产生。与人类研究一致，在易患狼疮的(MRL / lpr)小鼠的DN-T细胞中发现 IL-17 表达增加[25]。IL-17可以直接导致自身抗体产生和促进LN的进展。Amarilyo等[26]发现抗-ssDNA，抗-nRNP和抗染色质自身抗体的诱导是IL-17依赖性的(因为 IL-17-/-小鼠并未产生这些自身抗体)，但抗ds-DNA抗体的诱导却不是。经普瑞斯汀处理的IL-17-/-的小鼠的肾损伤明显低于经普瑞斯汀处理的WT小鼠，且缺乏免疫复合物(IgG、IgM)和C3沉积。Qiao等[27]证明A77 1726(来氟米特的活性代谢产物)在MRL-LPR小鼠中可显著抑制LN，其作用的发挥可能是通过抑制产生IL-17的DN-T细胞和促进Tregs而实现的。另有研究发现IL-17 可抑制Tregs扩增[28]。因此，减少产生 IL-17 的DN-T细胞有望预防MRL / lpr小鼠的LN。

SLE患者效应T细胞的一个关键特征就是IL-2表达减少[16]，这种细胞因子能够阻止 Th 17 细胞的产生并有利于调节性T细胞的生成。与CD4+或CD8+T细胞相比，DN-T细胞不能表达IL-2。

DN-T细胞表现出终末分化和衰竭T细胞的特征，如T细胞受体切除环(TRECs)含量低和表达抑制性分子程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)[20]。Rodriguez等[29]在小鼠DN-T细胞中发现一个自我反应亚群，其特征是表达PD-1和转录因子Helios。PD-1 通过抑制激活诱导的T细胞受体信号传导通路，参与维持外周耐受，从而限制炎症反应。但该机制在SLE中可能会以某种方式失效。总之，DN-T细胞可分泌促炎细胞因子特别是IL-17，表现出类似效应T细胞的作用，在SLE的致病中发挥重要作用。

激活雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)DN-T细胞可通过促进B细胞产生抗dsDNA抗体而进一步导致肾脏损伤。Lai等[30]发现在CD3/CD28共刺激下,mTORC1激活触发DN-T细胞产生IL-4，其与B细胞激活和dsDNA抗体产生有关。IL-4可能会阻止幼稚的CD4+T细胞分化FoxP3+Tregs，并抑制 FoxP3 表达。近年来雷帕霉素成为SLE治疗中的研究热点。mTOR活性受多种刺激(包括TCR信号传导，共刺激和细胞因子)的调控，这些信号可能在炎症刺激下更为丰富。雷帕霉素(西罗莫司)有效抑制抗原诱导的T细胞增殖，是一种经典的器官移植抗排斥反应的药物。小鼠研究表明，mTOR复合物(mTORC)1和2分别参与Th1/Th17细胞和Th2细胞的分化。Kato等[28]发现雷帕霉素对mTORC1封锁可以抑制DN-T细胞和CD4+T细胞中IL-4、IL-17增加，同时逆转FoxP3+Tregs的耗竭。而雷帕霉素不能抑制CD8+T细胞中IL-4的产生，因其是由GATA-3介导的(图1)。尽管mTOR阻断对于Treg 分化及其谱系稳定至关重要，但雷帕霉素治疗后低表达mTORC1的Tregs与高表达的mTORC1 Tregs之间的功能的差异尚有待确定。在一项西罗莫司治疗SLE的前瞻性研究发现[31]，在西罗莫司治疗12个月期间，SLE患者疾病活动逐步改善，SLE疾病活动度(SLE-DAI)评分逐步下降，促炎性 T 细胞谱系渐被校正，如基线时SLE患者DN-T细胞中的平均线粒体质量(SLE中氧化应激的重要来源)高于健康对照组，在西罗莫司治疗后减少;FoxP3+调节性T细胞与基线相比显著扩增(Z=4.09，P<0.001)；IgM 和 IgA 抗磷脂抗体产生减少，并持续12个月，这表明mTOR阻断可能使抗磷脂综合征(APS)患者受益。值得注意的是，mTOR 途径的激活通过依赖CREMα调控的S6激酶(mTORC1的底物)与转录因子CREMα相关联，CREMα的过表达引起DN-T细胞异常扩增。因此抑制CREMα诱导，不直接靶向mTOR，或二者联合，或许可更大程度限制DN-T细胞的扩增，并减少其产生的致炎性细胞因子。

展 望

DN-T细胞分泌各种细胞因子、诱导自身抗体产生，在SLE疾病发生发展过程中发挥重要作用。mTOR是调节DN-T细胞表型获得的中心元件，有望成为SLE潜在的重要的生物标志。雷帕霉素能降低SLE患者DN-T细胞 IL-4 和 IL-17 产生，可能是其治疗SLE的重要机制。CREMα还可通过表观遗传机制引起DN-T细胞的扩增；目前尚缺乏针对CREMα的药物，如何准确抑制CREMα 的诱导，及其与雷帕霉素联合治疗的有效和安全等仍有待进一步的研究。