环状RNA hsa_circ_0002715在系统性红斑狼疮患者全血中的表达和意义

罗 清，黄自坤，张 露，李俊明

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种病因不明的，常见的慢性系统性自身免疫性疾病，好发于育龄期妇女[1]。目前SLE的诊断主要依据临床表现和实验室检查，诊断标准由美国风湿病协会制定，符合11条中的4条即可诊断[2]。用于诊断的实验室指标主要为抗核抗体、抗双链DNA、抗Sm等，但是这些自身抗体敏感性或特异性较低，患者中阳性率也较低，有一定的误诊和漏诊[3]。环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是最近新发现的区别于传统线性RNA的一类特殊RNA，具有闭合环状结构[4]。此外，circRNA具有疾病和组织特异性，这使得circRNA在作为新型临床生物标记物的开发应用上具有明显优势。研究[5-6]显示circRNA可用于多种疾病的诊断、鉴别诊断、预后监测。在SLE中的作用也逐渐得到大家的认识[7]。该研究首次以全血环状RNA hsa_circ_0002715为研究目标，探讨其在SLE中临床意义以及诊断和鉴别诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年9月～2019年2月南昌大学第一附属医院风湿免疫科76例SLE患者，其中男6例，女70例；年龄10～66(40.2±16.4)岁，临床诊断符合美国风湿病学会1997年修订的分类标准[2]，并排除严重糖尿病、高血压、高血脂、心脑血管疾病、肝肾疾病、血栓性疾病、血小板疾病等其他疾病。正常对照组33例，均为健康志愿者，排除炎症或其他自身免疫性疾病，其中男4例，女29例；年龄19～84(42.5±13.3)岁。2组性别、年龄无显著性差异。详细收集SLE患者临床资料及相关实验室检查数据，并计算其SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)。此外，选取同期收治的56例初诊未治疗的类风湿关节炎和32例初诊未治疗的强直性脊柱炎作为非SLE疾病对照组，其中男34例，女54例；年龄13～84(43.1±14.4)岁。临床诊断分别符合美国风湿病学会1987年修订类风湿关节炎诊断标准[8]和美国风湿性学会强直性脊柱炎修订标准[9],并排除其他疾病。本实验经过医院伦理委员会批准，患者和健康人均签署知情同意书。

1.2 SLE治疗入选的76例SLE患者中47例为初诊未治疗者，其中7例初诊未治疗者于治疗前和治疗半个月后收集其空腹EDTA抗凝外周血用于PCR检测。初诊未治和复诊SLE患者均根据病情严重程度选取治疗方案：① 病情稳定(SLEDAI为0～4分)者维持治疗；② 病情轻度活动(SLEDAI为5～9分)者用泼尼松或糖皮质激素+羟氯喹/甲氨蝶呤/来氟米特治疗；③ 病情中度活动(SLEDAI为10～14分)者用糖皮质激素+环磷酰胺/霉酚酸酯治疗；④ 病情重度活动(SLEDAI≥15分)者先用糖皮质激素冲击加环磷酰胺，再按病情中度活动治疗方案治疗。

1.3 试剂和主要仪器TRIzol 试剂购自Invitrogen公司；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR ® Premix Ex Taq TM购自大连宝生物 TaKaRa公司；抗双链DNA抗体检测试剂盒购自上海科新生物技术股份有限公司；抗可提取核抗原抗体检测试剂盒购自德国欧盟公司；hsa_circ_0002715及内参基因β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度计购自美国Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型荧光定量PCR仪器购自美国ABI公司；特定蛋白仪IMMAGE800购自美国Beckman Coulter公司；动态血沉仪购自北京普利生公司；血常规检测仪购自日本希森美康。

1.4 全血总RNA提取采集受试者清晨空腹EDTA抗凝外周血2 ml，6 h内送检，取250 ml全血加用750 ml TRIzol试剂处理，放-80 ℃冰箱保存。按TRIzol试剂说明书分别提取SLE患者、非SLE患者和健康对照者全血的总RNA，焦碳酸二乙酯处理过的蒸馏水溶解RNA，采用RNA纯化试剂盒纯化总RNA。进一步使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度计对总RNA进行定量和质量分析。

1.5 RT-PCR检测采用RT-PCR SYBR Green法，以β-actin作为内参进行hsa_circ_0002715的检测。提取PBMC总RNA，DEPC水溶解后，取1 μl RNA，利用PrimeScript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用20 μl反应体系进行检测，PCR引物序列见表1。反应体系包括：1 μl反转录产物、0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1×SYBR荧光染料试剂。PCR 反应条件为：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、30 s，40个扩增循环。所有样品做3个复孔。RT-PCR使用ABI7500仪器进行。分析待测标本的扩增熔解曲线，均为单峰，无非特异性扩增。根据待测标本的Ct值，采用相对定量法对RT-PCR结果进行分析，计算2-ΔΔCt。引物序列见表1。

表1 荧光定量 PCR 引物序列

1.6 SLE的其他指标检测方法免疫球蛋白G、补体3、补体4、C-反应蛋白采用速率散色比浊法，抗双链DNA抗体采用酶联免疫吸附法，抗可提取核抗原抗体采用免疫印记法检测，血沉采用动态血沉仪法，血常规采用电阻抗法。

1.7 统计学处理实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，首先进行正态性检验，符合正态分布数据，2组样本均数的比较采用t检验，否则采用非参数检验。多组间非参数检验用于3组之间的比较，同时Dunn′s post-hoc test用于多组间非参数检验后的两两比较。2个变量之间相关性采用spearman相关分析。受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析评价circRNA诊断和鉴别诊断的敏感性和特异性。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全血环状RNA hsa_circ_0002715在SLE患者中表达的水平结果如图1A所示，采用多组间非参数检验分析表明SLE患者、非SLE患者和健康对照者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平，差异有统计学意义(P<0.001)；此外本文采用Dunn′s post-hoc test将检验效能调整后，再分析3组中两两组间比较显示，SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平高于对照者，差异有统计学意义(P<0.001)；SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平高于非SLE患者，差异有统计学意义(P<0.001)；但并未发现非SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平高于对照者，差异无统计学意义。

图1 全血环状RNA hsa_circ_0002715在健康对照者、非SLE患者、SLE患者中的表达水平

2.2 全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与SLE患者临床参数的关系本文分析了全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与SLE患者疾病活动性评分、补体3、补体4、免疫球蛋白G、自身抗体(抗双链DNA抗体、抗核小体抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗Sm抗体、抗nRNP/Sm抗体、抗核糖体蛋白P抗体)、血沉、C-反应蛋白、狼疮肾、血液系统损伤(白细胞数量、红细胞数量、血红蛋白、红细胞比积、血小板数量、淋巴细胞数量、单核细胞数量、中性粒细胞数量)、皮疹、关节炎、脱发、浆膜炎、治疗等临床参数的关系，结果如图2所示，SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与补体3(rs=-0.453，P<0.001)，补体4(rs=-0.336，P=0.004)呈负相关，与抗双链DNA抗体(rs=0.253，P=0.040)呈正相关，抗核小体抗体阳性的SLE患者其全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平高于抗核小体抗体阴性者(P<0.001)，差异有统计学意义。此外，本研究还显示SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平SLE患者的白细胞数量(rs=-0.486，P<0.001)、红细胞数量(rs=-0.297，P=0.009)、血红蛋白(rs=-0.277，P<0.016)、红细胞比积(rs=-0.303，P=0.008)、血小板数量(rs=-0.300，P=0.009)呈负相关；但并未发现其与疾病活动性评分、狼疮肾等临床表现以及治疗有关。

2.3 全血环状RNA hsa_circ_0002715对SLE诊断的价值为评估全血环状RNA hsa_circ_0002715对SLE的诊断价值，对SLE患者和健康对照者的全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平进行ROC分析，结果如图3A所示，ROC曲线下面积AUC为0.772(95%CI:0.683～0.861;P<0.001)，Cut-off值为1.939，敏感性为63.16%，特异性为81.82%，阳性预测值为88.89%，阴性预测值为49.09%，约登指数为0.450。

为评估全血环状RNA hsa_circ_0002715对SLE的鉴别诊断价值，对SLE患者与非SLE患者中全血环状RNA hsa_circ_0002715的表达水平进行ROC分析，结果如图3B所示，ROC曲线下面积AUC为0.674(95%CI:0.591～0.757;P<0.001)，Cut-off值为2.612，敏感性为55.26%，特异性为72.73%，阳性预测值为63.64%，阴性预测值为65.31%，约登指数为0.280；对SLE与所有对照者(非SLE患者+健康对照者)中全血环状RNA hsa_circ_0002715的表达水平进行ROC分析，结果如图3C所示，ROC曲线下面积AUC为0.701(95%CI:0.624～0.777;P<0.001)，Cut-off值为3.063，敏感性为51.32%，特异性为80.17%，阳性预测值为61.90%，阴性预测值为72.39%，约登指数为0.315。

2.4 全血环状RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、联合环状RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA对SLE诊断价值的比较本研究前面结果表明环状RNA hsa_circ_0002715对SLE诊断Cut-off值分别为>1.939(SLE患者vs健康对照者), >2.612(SLE患者vs非SLE患者)，>3.063(SLE患者vs非SLE患者+健康对照者)。76例SLE患者中有66例患者收集空腹EDTA抗凝外周血检测环状RNA hsa_circ_0002715时进行了anti-dsDNA检测，因此分别根据上述ROC曲线获得的Cut-off值和anti-dsDNA是否为阳性来分析三个队列(SLE患者vs健康对照者；SLE患者vs非SLE患者；SLE患者vs非SLE患者+健康对照者)中环状RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、联合环状RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA对SLE诊断的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，结果如表2所示，环状RNA hsa_circ_0002715的敏感性均高于anti-dsDNA，且联合环状RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA的敏感性和特异性均最高。

图2 全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与SLE患者临床参数的关系

表2 环状RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、联合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA对SLE的诊断价值

3 讨论

研究[10]表明circRNAs在血液中可长期稳定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成血液circRNAs的损失，比较适宜作为基本的临床诊断标志物。近期，国内外均有学者尝试探讨circRNAs作为SLE诊断标志物的可行性，并取得了可喜的成果，如Li et al[11]发现外周血hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090在儿童SLE中特异性高表达，且hsa_circ_0057762表达水平与SLE患者的疾病活动性评分呈正相关，进一步ROC曲线分析发现hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090的AUC均大于0.8，因此hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090可作为儿童SLE的一种潜在的新型分子标志物；Miao et al[12]研究发现外周血单个核细胞中circPTPN22可作为SLE诊断的标志物，且其含量与SLE患者的疾病活动性和严重程度密切相关；此外，Ouyang et al[13]发现血浆circRNA_002453在狼疮肾中明显上调，并且其含量与24 h蛋白尿和SLE肾损的活动性评分呈正相关，可作为狼疮肾诊断及严重程度评估的一种潜在的新型分子标志物。

图3 SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715的受试者工作曲线分析

环状RNA hsa_circ_0002715位于21号染色体，即21号染色体47801608-47805898(正链)，被 RNA 转录酶Ⅱ转录，其转录本有299 nt。本课题组之前研究采用芯片检测SLE患者全血环状RNA表达谱显示环状RNA hsa_circ_0002715明显上调。目前尚未见有关环状RNA hsa_circ_0002715的研究报道。为了研究环状RNA hsa_circ_0002715在SLE中的表达水平及其临床意义，本研究采用qRT-PCR检测76例SLE患者和33例健康对照者全血中环状RNA hsa_circ_0002715的表达水平发现，SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平显著高于健康对照组，差异有统计学意义。 进一步分析SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达的临床意义显示，SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与SLE患者监测疾病活动的常用指标补体[1]水平呈负相关；且SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与anti-dsDNA、anti-nuclesome含量相关，而anti-dsDNA、anti-nuclesome也是目前临床上常用的监测SLE患者疾病活动性指标和SLE诊断指标[1,14]；此外，本研究还显示环状RNA hsa_circ_0002715与SLE患者血液系统受累(WBC减少、RBC减少、PLT减少、贫血)情况相关。这些结果表明环状RNA hsa_circ_0002715表达水平与疾病活动性和血液系统受累严重程度呈正相关，即患者疾病越严重，hsa_circ_104871分子的表达水平越高。

本研究采用ROC曲线分析环状RNA hsa_circ_0002715的诊断价值发现，SLE患者环状RNA hsa_circ_0002715的AUC为0.772(95%CI:0.683～0.861;P<0.001)，Cut-off值为1.939，敏感性为63.16%，特异性为81.82%，可有效地从HC中诊断出SLE患者。另外，SLE可累及关节，患者经常会有关节疼痛等症状，临床上容易与RA和AS等其他自身免疫性疾病混淆，为此本研究比较了SLE患者与non-SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715的表达水平发现，SLE患者环状RNA hsa_circ_0002715表达水平显著高于non-SLE患者，差异有统计学意义。进一步的ROC曲线分析证实其可有效将SLE患者与non-SLE患者区别开来，可用于SLE的鉴别诊断。此外，anti-dsDNA是公认的SLE诊断指标，但其诊断敏感性较低，为40%～50%[15]，且有研究[15]显示anti-dsDNA联合其他SLE诊断指标可明显提高其诊断敏感性和特异性。本研究比较hsa_circ_0002715，anti-dsDNA，联合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA的诊断效能显示，hsa_circ_0002715对SLE的诊断敏感性要高于anti-dsDNA，但差异无统计学意义，而联合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA对SLE的诊断敏感性和特异性均提高，差异有统计学意义。因此，全血环状RNA hsa_circ_0002715，尤其是联合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA是可用于SLE患者的诊断以及鉴别诊断。

综上，SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0002715的表达明显上调，且与疾病活动性和血液系统受累的严重程度密切相关，可作为SLE的潜在诊断及鉴别诊断标志物。相信随着研究的深入和检测技术的提高，CircRNAs有望成为SLE乃至其他自身免疫性疾病新的血液标志物，改变和补充传统SLE实验室诊断标准。