葡萄籽原花青素对稳定apoE基因敲除小鼠易损斑块的影响及机制

贾敏，路永刚，崔秋英，高伟，帖彦清

河北省人民医院，石家庄050051

易损动脉粥样硬化(AS)斑块是导致冠心病、心肌梗死、脑卒中等致死、致残疾病的主要病因。AS斑块的稳定性与高脂血症、代谢性疾病和吸烟等刺激因素导致的氧自由基增加及其诱导的细胞凋亡密切相关[1]。葡萄籽原花青素(GSP)是从葡萄籽中提取出的生物类黄酮[2],一种抗氧化剂和自由基清除剂。其抗氧化、清除自由基等作用优于维生素C、维生素E，还具有抗炎、抗衰老、抗辐射等多种药理作用[3,4]。但目前关于GSP对AS的疗效研究相对较少，作用机制尚未阐明。2018年4月～2019年5月，我们制备了apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠AS模型，观察GSP对AS易损斑块的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 apoE-/-小鼠购自北京维通利华公司，体质量(20±2)g，饲养于SPF级环境中，室温(22±0.2)℃，自由饮食水。适应性喂养7 d后，给予1.25%胆固醇高脂饲料饲养，达到8周时即构建易损斑块动物模型。随机分为GSP低剂量组、GSP中剂量组、GSP高剂量组和模型组，每组6只。GSP低、中、高剂量组分别予以GSP溶液45、90、180 mg/(kg·d)灌胃，模型组给予同体积生理盐水灌胃，各组均干预8周。

1.2 主动脉根部斑块面积测算 干预8周后，水合氯醛麻醉并固定小鼠，无菌条件下打开小鼠胸腔，在生理压下应用冰生理盐水灌流直至肝脏发白后，分离降主动脉，多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，包埋，切片，HE染色后拍照。采用Graph Pad Prism6.0软件测量主动脉根部斑块面积。

1.3 主动脉根部斑块内容物面积测算 采用免疫组化及特殊染色法测算斑块内巨噬细胞及胶原阳性区域面积。主动脉根部切片脱蜡至水，双氧水去脱氧化物酶，羊血清封闭后加MAC-2一抗(1∶200稀释)4 ℃过夜孵育，PBS洗脱3次，加相应辣根过氧化物酶标记二抗常温孵育45 min后PBS洗脱3次，DAB显色。棕色示巨噬细胞，红色示胶原蛋白。使用IPP6.0软件计算斑块内巨噬细胞(棕色)和胶原(红色)阳性区域面积。

1.4 主动脉根部活性氧(ROS)检测 采用DHE荧光法检测斑块内ROS水平。主动脉根部石蜡切片常规脱蜡至水，DHE终浓度选择30 μmol/L，37 ℃孵育30 min后PBS冲洗未结合探针，避光保存。以斑块内DHE阳性面积(红色荧光所示)反映ROS水平。

1.5 主动脉根部细胞凋亡检测 采用TUNEL法检测斑块内细胞凋亡情况。主动脉根部连续石蜡切片，脱蜡后经Proteinase K消化、加标记缓冲液、生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Bioti)反应后，再结合FITC。FITC在490～495 nm激化，在520～530 nm发射荧光，呈黄绿色，然后滴加抗荧光淬灭剂、封片后在荧光显微镜下采集斑块内细胞凋亡图片并分析，凋亡的细胞核呈黄绿色。测算斑块内TUNEL阳性面积，反映细胞凋亡情况。

1.6 降主动脉凋亡相关蛋白表达检测 采用Western blotting法检测凋亡相关蛋白Cytc、cleaved Caspase-3和Bax的表达。取模型组与GSP高剂量组标本，将液氮和降主动脉一起放入研钵中研磨后，收集至1.5 mL EP管中，加入RIPA裂解液提取总蛋白(蛋白保存于-80 ℃冰箱中)，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，每孔上样量20 μg，分离并转膜5%脱脂奶封闭后加入相应一抗(Cytc 1∶1 000、cleaved Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 500)4 ℃封闭过夜，加二抗(1∶10 000羊抗兔IgG洗涤)，37 ℃孵育2 h后加入发光剂，ECL显色，扫描分析条带灰度值，以目的条带灰度值与内参β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组主动脉根部斑块面积及斑块内容物面积比较 见表1。

表1 各组小鼠主动脉根部斑块面积及斑块内容物面积比较

2.2 各组小鼠主动脉根部ROS水平及细胞凋亡情况比较 见表2。

表2 各组小鼠主动脉根部斑块ROS水平及细胞凋亡情况比较

2.3 各组降主动脉凋亡相关蛋白表达比较 见表3。

表3 各组降主动脉凋亡相关蛋白表达比较

3 讨论

AS斑块是多种心脑血管疾病如心肌梗死、冠心病、脑梗死等疾病的病理学基础。氧化应激是指机体或细胞内氧自由基产生与清除失衡，导致ROS在体内和细胞内聚集引起的氧化损伤的过程。大量研究显示，血管壁可产生多种ROS，可以直接对血管壁造成损害，如影响血管内皮功能、诱导细胞凋亡、促进血管平滑肌细胞的迁移和增殖等，参与AS的发生和发展[5～8]。GSP是从葡萄籽中提取出来的一类多酚化合物，具有极强的抗氧化活性，是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂。目前，GSP对AS的作用鲜有相关研究报道[1～4]。

斑块面积是评估AS进展最明显的指标。斑块内巨噬细胞是最主要的ROS来源，可分泌多种、大量的炎症因子和基质金属蛋白酶如IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-2、MMP-9等，加速斑块组织结构破坏，募集更多循环单核-巨噬细胞，形成恶性循环。ROS可促进巨噬细胞凋亡形成坏死核心，使AS软化，促进斑块破裂和后期血栓形成，而胶原是AS的刚性成分，有利于维护斑块成分，防止斑块破裂[9～11]。本研究发现，GSP高剂量组主动脉根部斑块面积、巨噬细胞面积均低于模型组，胶原面积高于模型组，表明经180 mg/kg GSP处理后，apoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块面积显著减小，巨噬细胞减少并伴随着胶原成分升高和坏死核心减少，提示GSP具有明显的稳定易损斑块的作用。

ROS是促进AS进展的重要因素，参与了AS的所有过程，在正常状态下ROS的产生和清除处于一种动态平衡中，使细胞、器官处于正常状态，而在AS斑块中ROS明显增多。本研究发现，GSP高剂量组主动脉根部斑块内红色荧光面积低于模型组，提示经180 mg/kg GSP处理后斑块内ROS水平降低，表明GSP显著减轻了小鼠体内的氧化应激反应。

线粒体是参与凋亡的重要部位[12～15]，其中Cytc是线粒体呼吸链必备的一类色素蛋白，在激活和诱导细胞凋亡方面发挥了决定性作用。在巨噬细胞凋亡过程中，Cytc通过线粒体外膜释放，促凋亡因子刺激下Cytc从线粒体释放至细胞质中，之后激活Caspase-3启动凋亡级联反应[12]，其中最主要的促凋亡蛋白为Bax[15]。本研究发现，GSP高剂量组主动脉根部斑块内TUNEL阳性面积低于模型组，GSP高剂量组促凋亡蛋白Cytc、cleaved Caspase-3和Bax表达均低于模型组，提示GSP显著抑制了上述3种促凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡。

综上所述，180 mg/kg的GSP对小鼠主动脉AS斑块具有稳定易损斑块、减小斑块面积、抑制巨噬细胞聚集及细胞凋亡作用，其机制可能与抑制ROS产生、减少促凋亡蛋白表达有关，GSP有望作为心血管治疗药物新的研究方向。