木霉P3.9菌株对枇杷根际土著细菌数量的影响

鲁海菊 李丽莎 谢欣悦

摘要：以枇杷内生木霉P3.9菌株为供试菌株，用稀释涂布平板法与种群密度法，检测木霉P3.9菌株对枇杷根际土著细菌数量的影响。结果表明，在5～25 d期间，以5 d为周期处理组细菌数量前10 d呈减增变化，后10 d细菌数量持续减少。对照组细菌数量前5 d减少，10～15 d期间保持稳定，后5 d增加。木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤 20～80 d期间，处理组细菌数量变化趋势与对照组完全一致，其中在20～50 d期间，处理组细菌数量波动幅度大于对照组。80～90 d期间，处理组细菌数量变化趋势与对照组相反。将木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤3个月内，处理组细菌数量明显高于对照，木霉P3.9菌株可促使枇杷根际土壤细菌数量增加。

关键词：枇杷;木霉;根际土著细菌;根际土壤;细菌数量

中图分类号： S436.67+9  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0089-03

收稿日期：2019-06-30

基金项目：国家自然科学基金（编号：31660147）;云南省应用基础研究计划（编号：2016FB066）;红河学院应用型科学研究重点项目（编号：XJY15Z06）。

作者简介：鲁海菊（1978—），女，云南大理人，博士，教授，主要从事植物病理学研究。E-mail：luhaiju2011@126.com。  枇杷（Eriobotrya japonica）为常绿小乔木，可药食两用[1-2]，是云南蒙自地方特色水果之一。由于枇杷种植面积不断扩大，病害日趋严重[3]。据文献记载，蒙自枇杷有5种常见病害，分别为圆斑病、灰斑病、角斑病、炭疽病、根腐病[4]，其中根腐病作为土传病害最为严重，具体表现为叶片变黄脱落，茎干呈褐色，基部腐烂，严重时整株死亡，发病率超过40%，严重阻碍了枇杷产业的可持续发展。曾尝试用农业防治和化学药剂防治手段控制此病害，但其效果不理想。因此，生物防治成为防治枇杷根腐病的有效方法之一。木霉（Trichoderma spp.）在植物土传病害防治中已占90%以上，可用于防治植物叶部和根部病害[5]，抑制多种植物病原真菌[6]，曾与化学农药混配有效控制猕猴桃软腐病[7]。鲁海菊等分离出1株源自枇杷主干的木霉P3.9菌株，发现该菌株抗菌谱广[8]、对根际土壤真菌[9]及枇杷内生真菌[10]有抑制作用，且其发酵工艺简单[11]，对枇杷植株有促生作用，能定殖于枇杷根际土壤及其植株各个器官[12]，开发利用前景广阔。

研究发现，在甜瓜[13]、黄瓜[14-15]、苜蓿[16]、草坪[17]、辣椒[18]根际中引入木霉会引起细菌数量在一定时间内增加或减少，同时木霉对土壤微生态有调节作用甚至能与植物共生。土著细菌作为土著微生物成员之一，直接关系到植株生长，陈立华指出木霉能使土著细菌数量增加，病原菌数量减少[19]。为探明木霉P3.9菌株对枇杷根际土著细菌数量有无类似的影响，本研究用稀释涂布平板法[20]测定木霉P3.9菌株对枇杷土著真菌数量的影响，以期为其防治枇杷根腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 内生木霉（Trichoderma atroviride）P3.9菌株分离自枇杷主干韧皮部，保存于红河学院生命科学与技术学院植物病理学标本室。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，1 000 mL 自来水，pH值自然。

营养琼脂（NA）培养基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，20 g琼脂，1 000 mL蒸馏水，pH值自然。

上述培养基配好后均在121 ℃高压灭菌 30 min。材料均购自农贸市场及试剂公司，试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌悬液接种根际土壤的方法 将试管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化，待菌落长满培养皿后，用打孔器取5 mm的菌饼，接入PDA平板中央。共培养5皿，置温度为28 ℃条件下培养5～7 d;待菌落长满培养皿后，收集所有培养物至粉碎机，并加入适量无菌水，充分打匀，制成菌悬液，调整孢子液浓度至1×106 CFU/mL备用。将枇杷嫁接苗种植于营养袋（23 cm×18 cm）中，苗龄为1年时做接种试验。用上述木霉孢子悬浮液灌根500 mL/株，灌根等量清水作为对照，设10次重复，常规肥水管理。

1.2.2 枇杷根际土壤细菌菌悬液的制备 在灌根木霉孢子悬浮液5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 d时，用高为0.5 m，钻头直径为38 mm的取样不锈钢环刀土钻;处理和对照枇杷苗分别随机取5株，每株用5点取样法，采集深度为5～20 cm的根际土样，用四分法充分混匀土样备用。处理和对照各称1 g根际土樣置于装有 99 mL 无菌水的三角瓶中，在振荡仪器上以 200 r/min 振荡20 min，配制成10-1悬液，静置 2 min，用无菌微量移液器吸取1 mL，加入到9 mL无菌水中即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液。

1.2.3 枇杷根际细菌测定 取100 μL 10-8土壤稀释悬浮液，采用倾注法加入平板培养基中，设5次重复。于28 ℃恒温培养箱中培养，3～5 d后计数平皿上的细菌菌落，计算根际细菌种群密度。

依照以上方法统计施入木霉孢子悬浮液5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 d时，根际细菌的数量变化情况，计算菌落数，计算公式为种群密度（CFU/g）=每个培养皿中菌落平均值×稀释倍数×10×水分系数。

1.2.4 数据统计 所得数据用Excel进行汇总，采用平均值计算与作图，所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件Duncans多重比较法进行统计分析，计算处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤5～40 d细菌数量变化

由表1可知，木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤5～40 d期间，处理组细菌数量前5 d减少，其他时间以15 d为周期呈循环增减变化，前5 d增加，后10 d减少。对照组细菌数量前5 d减少，10～15 d数量保持稳定，15～35 d期间以10 d为周期呈循环增减变化， 35～40 d期间细菌数量减少。处理组细

2.2 木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤40～65 d细菌数量变化

由表2可知，木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤40～65 d期间，处理组细菌数量变化规律与对照组一致。前10 d细菌数量先增后减，之后10 d增加，最后5 d减少。除45 d时处理组较其他时期呈现略微的升高外，细菌数量变化趋势相同。处理组细菌数量明显高于对照组。

2.3 木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤65～90 d细菌数量变化

由表3可知，木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤65～90 d期间，前15 d处理组与对照组细菌数量变化一致，呈增减增的变化趋势。后10 d处理组细菌数量呈先增后减的变化趋势，对照组细菌数量呈先减后增的变化趋势。处理组细菌数量明显高于对照组。

2.4 木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤5～90 d细菌数量变化

5～20 d期间，以5 d为周期处理组细菌数量前10 d呈减增变化，15～25 d细菌数量持续减少。对照组细菌数量前5 d减少，10～15 d期间保持稳定，15～20 d增加。处理组细菌数量波动幅度大于对照组。在20～80 d期间，处理组细菌数量变化趋势与对照组基本一致，其中，在20～50 d期间，处理组细菌数量波动幅度大于对照组。在80～90 d期间，处理组细菌数量变化趋势与对照组相反。3个月内处理组细菌数量明显高于对照组。

3 结论与讨论

木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤5～90 d期间，能促进枇杷根际细菌数量增加，在15 d达到最大值，为1.14×1010 CFU/g。本研究结果与尹丹韩等报道的结果[14，17，21-22]一致。尹淑丽等报道，黄瓜根围接种木霉对细菌的数量影响不明显[23]。尹丹韩研究证明，黄瓜根围细菌的数量群落变化不受接种木霉菌剂影响[24]。本研究结果与之不一致。王秋君研究发现，土壤肥力高，细菌和真菌数量多[25]。吴凡等也提出，肥沃土壤根际细菌、放线菌的数量多[26]。说明土壤细菌种群的数量和结构与土壤肥力呈正相关。木霉P3.9菌株能导致枇杷根际细菌数量增加，增强土壤肥力，发挥促进枇杷生长的功能[12]，另外，此木霉菌株抗菌谱广[8]。说明木霉P3.9菌株具有药肥两用的功能，应用前景广阔，应进一步开发。

参考文献：

[1]李大庆，夏忠敏，杨再学，等. 余庆县枇杷病虫发生种类及危害情况调查研究[J]. 现代农业科技，2014（13）：116-117.

[2]许丽群. 枇杷栽培管理技术[J]. 北京农业，2013（33）：171-172.

[3]胡忠荣. 抓住“一带一路”的发展机遇促进云南高原特色优势水果产业发展[C]//云南省科学技术协会、中共普洱市委、普洱市人民政府. 第七届云南省科协学术年会论文集——专题二：绿色经济产业发展，2017：6.

[4]鲁海菊，卢宁强，杨 梅，等. 从枇杷根际土壤真菌中筛选抗其根腐病病菌的菌株[J]. 西南农业学报，2014，27（5）：1961-1964.

[5]张树武，徐秉良，薛应钰，等. 长枝木霉T6菌株对黄瓜南方根结线虫的防治及其根际定殖作用[J]. 应用生态学报，2016，27（1）：250-254.

[6]杨万荣，邢 丹，蓬桂华，等. 木霉菌生物防治辣椒疫病的研究进展[J]. 现代农业科技，2015（19）：127-129.

[7]胡容平，石 军，林立金，等. 四川猕猴桃软腐病防治初步研究[J]. 西南农业学报，2017，30（2）：366-370.

[8]鲁海菊，张建春，杞敬香，等. 枇杷内生木霉P3.9菌株抗菌谱研究[J]. 北方园艺，2014（24）：103-107.

[9]沈云玫，张建春，李 河，等. 枇杷根际土壤真菌对生防木霉菌株P3.9的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（4）：106-108.

[10]鲁海菊，张建春，沈云玫，等. 枇杷内生真菌对P3.9生防木霉菌株的抑菌作用[J]. 湖北农业科学，2014，53（11）：2547-2550.

[11]鲁海菊，王 波，潘柳君，等. 深绿木霉P3.9生防菌株固体发酵条件优化筛选[J]. 北方园艺，2014（14）：119-123.

[12]鲁海菊，沈云玫，陶宏征，等. 内生木霉P3.9菌株的多功能性及其枇杷根腐病的盆栽防效[J]. 西北农业学报，2017，26（11）：1681-1688.

[13]郁雪平，朱伟杰，高观朋，等. 生防木霉菌Th2和T4对甜瓜根围土壤微生态的影响[J]. 植物保护学报，2009，36（6）：522-528.

[14]尹丹韩，高观朋，夏 飞，等. 生防菌哈茨木霉T4对黄瓜根围土

壤细菌群落的影响[J]. 中国农业科学，2012，45（2）：246-254.

[15]李世贵. 两种木霉菌对黄瓜枯萎病菌生防作用及根际土壤微生物影响研究[D]. 北京：中国农业科学院，2010.

[16]尹 婷. 深绿木霉T2对微生物种群数量的影响及抗药菌株的筛选[D]. 兰州：甘肃农业大学，2012.

[17]古丽君，徐秉良，梁巧兰，等. 生防木霉对草坪土壤微生物区系的影响及定殖能力研究[J]. 草业学报，2013，22（3）：321-326.

[18]燕嗣皇，吴石平，陆德清，等. 木霉生防菌对根际微生物的影响与互作[J]. 西南农业学报，2005，18（1）：40-46.

[19]陈立华. 哈兹木霉及其微生物有机肥对黄瓜土传枯萎病的生物防治及其机理[D]. 南京：南京农业大学，2011.

[20]沈 萍，范秀容，李广武. 微生物学实验[M]. 北京：高等教育出版社，1999：49-95.

[21]朱双杰，董丽丽. 哈茨木霉T23和3种土壤有益细菌的相互作用对白菜生长的影响[J]. 淮北煤炭师范学院学报（自然科学版），2008，29（2）：44-48.

[22]刘登望. 拌种剂对花生产量、品质及根际土壤微生物的影响[D]. 长沙：湖南农业大学，2010.

[23]尹淑丽，麻耀华，张丽萍，等. 不同生防菌对黄瓜根际土壤微生物数量及土壤酶活性的影响[J]. 北方园艺，2012（1）：10-14.

[24]尹丹韩. 生防菌P.fluorescens 2P24、CPF10、T.harzianum T4对黄瓜根围土壤细菌群落的影响[D]. 上海：华东理工大学，2011.

[25]王秋君. 稻麦轮作系统中施用有机无机复混肥对作物生长及土壤肥力的影响[D]. 南京：南京农业大学，2012.

[26]吴 凡，李传荣，崔 萍，等. 不同肥力条件下的桑树根际微生物种群分析[J]. 生态学报，2008，28（6）：2674-2681.李君君，戴玲玲，顾安乐，等. 30%毒死蜱微胶囊悬浮剂的制备[J]. 江苏农业科学，2020，48（11）：92-95.