现代生物技术在木薯育种中的应用

朱涵钰

摘要    木薯是世界上重要粮食作物和经济作物，其遗传改良日益受重视。现代生物技术在培育优良木薯品种方面具有时间短、效率高等优势。本文介绍了近年来诱变育种、分子标记辅助选择育种、转基因工程等现代生物技术在木薯育种中的研究与利用概况，为利用现代生物技术加快获得具有产量高、抗逆性强、品质高等优良特性的木薯新品种提供参考。

关键词    木薯;现代生物技术;育种

中图分类号    S533;S33        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）13-0039-04                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    Cassava （Manihot esculenta Crantz） is an important food and economic crop in the world， and its genetic improvement has been paid more and more attentionco. Modern biotechnology has advantages of short time and high efficiency in cultivating excellent cassava varieties. This article introduced the recent research and utilization of modern biotechnology in cassava breeding such as mutation breeding， molecular marker-assisted selection breeding  and transgenic breeding， in order to  provide a reference for accelerating the acquisition of new cassava varieties with excellent characteristics such as high production， strong resistance， and high quality by modern biotechnology.

Key words    cassava; modern biotechnology; breeding

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）植物，与红薯、马铃薯合称世界三大薯类，是该属植物中唯一的栽培种。木薯起源于南美洲的亚马逊河流域，距今已有4 000年的人类利用史，目前广泛种植于非洲、亚洲和美洲等110余个国家或地区。19世纪20年代木薯由华人从马来西亚传入中国广东，再传播到海南、云南及广西等地。

木薯用途十分广泛，作为热带地区第三大粮食作物、全球第六大粮食作物，被称为“淀粉之王”[1]，是世界近6亿人的口粮。同时，木薯是最廉价的淀粉来源，可加工成酒精等各种工业产品，解决石油资源短缺等问题。我国每年木薯种植面积约60万hm2，但远远不能满足国内对淀粉产品的需求。因此，保障木薯高产、稳产、优质这个目标一直促使育种家去培育种质更加优良的木薯品种。

常见的木薯品种培育有2种方式，包括常规杂交育种和以现代生物技术为基础的分子育种。木薯的常规育种由于木薯基因高度杂合、遗传背景复杂、自交不亲和、花粉育性低、后代性状分离严重以及优质种质资源匮乏等问题，导致常规育种具有时间长、选择效率低等特点。近年来，植物生物技术迅速推广，在改良植物品质方面的应用逐渐成熟。现代生物技术在培育木薯优良品种方面具有以下几个方面的优势：一是木薯是以无性繁殖为主的作物，转入基因不存在分离现象，可短时间内得到优良的抗性品种;二是木薯一般秋季开花，花期较长，成熟时即可收获，不存在花粉漂移导致的外源基因扩散等问题;三是木薯在我国主要作为工业原料，食用比例很小，基本无需担心转基因木薯的安全性。

本文重点介绍近年来的几种主要生物技术，包括诱变育种、分子标记辅助选择育种、转基因育种等在甘薯育种中的发展与应用，以期促进木薯分子育种工作的开展。

1    诱变育种

木薯是一种无性繁殖作物，其育种过程中变异来源主要来自于自然变异与人工诱变产生的变异，但自然条件下外界环境的变化和遗传结构的不稳定性产生的突变频率较低。因此，利用γ射线、60Co处理等辐射诱变的方式和秋水仙素等化学诱变成为木薯种质创新研究的有效技术手段。另外，近年来利用TILLING等分子生物学技术的发展，为无性繁殖作物细胞工程育种提供了新的动力[2]。

γ射线诱变育种可创造高频率的变异，获得具有稳定遗传特性的突变体，可作为木薯选育种的有效途径。陆柳英等[3]利用辐射剂量率为1 Gy/min的γ射线对胚状体子叶、体细胞胚和带单芽茎段进行不同剂量的辐射处理，结果显示，辐射剂量在10～20 Gy之间对胚状体的子叶和体细胞胚更有效，而木薯单芽茎段γ射线辐射的剂量需低于10 Gy。Asare等[4]对IITA来源的几个材料的种茎利用γ射线进行辐射诱变，在M1V3和M1V4代进行材料鉴定筛选，获得高产和高抗病性的突变株系，同时薯块加工性也得到显著提高。Joseph等[5]利用辐射强度为50、100、200、300 Gy的γ射线对木薯PRC60a的不同时期体细胞胚、子叶和嫩叶进行处理，结果显示，球形体细胞胚可获得一系列在植株表型及块根特性方面差异表现的突变株系，相对子叶和嫩叶可作为最适合的外植体;其中S15在直链淀粉含量和淀粉含量相比野生型分别下降30%和50%。Sanchez等[6]对木薯种子进行γ射线诱变，经过M1与M2 2代鉴定筛选获得一批淀粉颗粒小、直链淀粉含量高等性状的突变株系，在木薯淀粉降解和食品工业上有重要经济应用价值。因此，γ射线诱变育种可创造具有稳定遗传性的突变体，是有效的木薯育種途径之一。

化学诱变育种是利用甲基磺酸乙酯（EMS）、秋水仙素等化学诱变剂处理植物材料，使之产生形态特征的变异，然后通过多世代对这些变异进行鉴定、选择和培育，最终育成新品种。化学诱变是一种迅速发展的育种途径，具有成本低、诱变作用专一性强等特点。陆柳英等[7]利用EMS对木薯品种华南124和华南8号的组培苗带芽茎段进行诱变，初步建立了以带芽茎段为外植体EMS诱变技术方法。胡小元等[8]用EMS和NaN3处理木薯组织的顶端2个茎节，相比γ射线和快中子处理等物理辐射产生相近的效果，其所产生的损伤相对较易恢复。另外，秋水仙素也是一种诱导效率较好的处理方式。Nassar等[9]通过秋水仙素诱导染色体加倍、远缘杂交等技术，获得UnB201、UnB310等各类木薯多倍体材料，且在产量、品质等方面表现出明显优势。GR4X系类则是广西壮族自治区热带作物研究所通过秋水仙素进行木薯多倍体诱变育种选育出来的优良木薯品系。

2    分子标记辅助选择育种

分子标记技术自诞生以来，目前成为现代作物育种中不可缺少的工具，在玉米、大豆等农作物上均有成功应用的案例。基因发现和定位、分子育种、后代性状表现预测和基因组选择等分子生物学技术与传统育种技术相结合，可提高育种效率，缩短育种周期。木薯的产量、品质等大多数农艺性状以及与抗病性相关的性状均表现为数量性状遗传，且各性状表现一定的相关性。因此，分子标记辅助（MAS）选择对木薯育种进程的加快具有重大意义。

2.1    构建甘薯分子遗传图谱

由于木薯的基因高度杂合，遗传背景较复杂，对木薯基因组的研究相对滞后，分子标记的数量和种类及遗传图谱的构建相对匮乏。1997年Ceballos等[10]利用RFLP标记、RAPD标记构建了第1张木薯分子遗传图谱，成为木薯重要性状的遗传分析与研究的重要参照工具。之后，国内外学者先后对木薯分子遗传图谱的构建进行了探索与研究。随着生物技术的发展，SSR标记克服RFLP标记标记密度低及RAPD无法区分杂合子与纯合子的缺点，成为木薯分子遗传图谱的构建中的主要标记。Okogbenin等[11]于2006年利用木薯自交系F2代群体，构建了一张包含100个SSR标记的遗传图谱。Kunkeaw等[12]利用木薯的F2代群体构建了一张包含510个EST-SSR/SSR混合标记的遗传图谱。Chen等[13]利用木薯的杂交F1代群体，构建了包含200个AFLPs、EST-SSRs和SSRs混合标记的遗传图谱，总长度达到1 645.1 cM，满足定位需求。Ekogbenin等構建的木薯分子遗传图谱就是基于开发的472个SSR标记和鉴定的100个SSR标记。Fregene等[14]对木薯品种CM2177—2和TMSI30572杂交产生的150个F1代株系开发了172个SSR标记用以构建木薯遗传连锁图谱。近几年，随着高通量测序技术的发展，为高密度遗传图的构建提供了契机，单核苷酸多态性标记（SNP）分子标记又成为研究热点。Rabbi等[15]对180个木薯分离群体利用GBS（genotyping-by-sequencing）技术进行测序，构建了包含6 756个SNP标记的木薯第1张高密度遗传图谱。Xia等[16]利用木薯分离群体的85个株系，构建了一张含有2 331个SNP标记、537个INDEL标记和164个甲基化位点的遗传图谱。Pootakham等[17]对16个木薯品种进行转录组测序并进行分析，最终得到了一张包含2 110个EST-SNP标记的遗传图谱。Ramu等[18]对241个木薯群体进行全基因组重测序，构建了包含了2 600万个SNPs和190万个indels的木薯单倍型图谱（HapMapII），可作为木薯分子标记辅助选择育种的重要遗传图谱。

2.2    木薯种质遗传多样性分析

目前，全球收集的木薯种质逾8 500份，主要来自非洲、东南亚、南美洲等地区。虽然木薯引种到我国距今已有200年的种植历史，但我国的木薯材料收集、保存和利用相对较晚，但也取得了一定的成绩。目前，在海南儋州建立了属于中国的木薯种质资源圃，共收集逾500份木薯材料，进行品种的表型、产量、品质及抗逆性等性状的考察评价，建立每个材料的档案，为木薯育种奠定基础。随着分子标记的发展，木薯材料亲缘关系及遗传多样性分析得以进行，从而为木薯种质的保存和利用提供更加准确的方法。Fregene等[19]利用SSR标记对来源秘鲁、巴西和哥伦比亚等国的283个木薯地方品种进行多样性的分析评价，结果显示，不同区域来源的木薯种质具有复杂的遗传多样性，其中来自哥伦比亚和巴西的木薯材料基因多样性水平最高，具有丰富的基因变异。韦祖生等[20]等利用EST-SSR分子标记引物对76份木薯材料（包括37份国内种质和39份引进种质）进行遗传多样性分析，结果表明，39份引进种质区别于国内种质遗传类型，丰富了我国的木薯种质资源。王  明等[21]利用44对SSR引物对195份国内（外）品种（系）进行遗传多样性分析，可将供试材料分为7个亚群，各品种（系）的遗传相似系数（GS）分布在0.57～0.99之间。张圣奎等[22]利用25 989个SNP和indels标记对158 份不同来源（包括中国、南美洲等地）的木薯群体进行遗传多样性评估，发现群体结构可划分为3个亚群，遗传多样性指数为1.21×10-4。主成分分析和进化树分析表明，木薯的亚群主要受其起源地影响，而与种质采集地没有明显的分化关系。另外，通过对遗传多样性的整理和总结，构建木薯种质资源的指纹图谱，为木薯品种的管理和推广奠定基础。如齐兰等对18份高淀粉木薯材料DNA指纹图谱的构建，为木薯品种的真实度鉴定、品种保护提供依据。

2.3    木薯基因定位和DNA分子标记辅助选择育种

木薯块根产量、抗病性、品质等重要农艺性状均属于微效多基因控制的数量性状。随着分子标记技术的发展，构建木薯的连锁图谱。通过QTL定位和关联分析，对重要农艺性状进行基因定位克隆，进而改良木薯品种抗病等特性，成为木薯育种研究的重要方向。Akano等[23]和Lokko等[24]采用集团分析法（BSA）分别对木薯不同的F1分离群体进行抗花叶病性状的QTL定位，结果发现，抗性标记SSRY28可解释的群体变异超过50%。Pootakham等[25]利用自己构建的高密度遗传图谱，定位了2个木薯淀粉糊化特性QTL，其中一个和前人的报道一致。Wang等[26]利用木薯自然群体对一些抗旱性相关性状进行关联分析，得到53个相应的QTL位点，平均可以解释8.6%的表型变异。Welsch等[27]对木薯薯肉颜色的研究中发现，VA的含量高低与黄色薯肉有关，由八氢番茄红素基因PSY中的一个SNP位点变异决定，而且该SNP位点可以开发为CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences）标记，用于木薯品种的选育。CIAT和尼日利亚国际热带农业研究所（IITA）专家利用传统育种和分子标记辅助选择技术，成功培育出抗花叶病的木薯品种CR41-10并释放到市场中。吉家敏等[28]结合主产区木薯遗传群体的8个复杂重要性状，进行木薯耐寒、产量与品质相关QTLepi和QTL定位，发掘候选基因WRKYre CT-QTLTFs、WRKY31和WRKY9等，为木薯的耐寒性品种改良提供技术支持。

3    转基因育种

转基因技术是作物育种方法的一次革命。经过120多年的发展，转基因如今已被广泛应用农业作物育种中，用于提高作物产量和改良作物品质，给人类带来巨大的经济和社会效益。相对于其他作物，木薯的转基因育种研究起步较晚。

3.1    品质改良转基因工程

除种子外，木薯其他组织中均含有低毒的氰苷物质，其组成为亚麻苦苷和百脉根苷。氰苷物质在胃酸和特殊酶的作用下会被分解成对人体有毒的氢氰酸，中毒后会发生呼吸困难、心跳加快、呕吐、昏迷等不良症状。因此，减少甚至清除木薯块根中氰化物含量，提高食用安全性与加工品质，是现代木薯育种研究中亟待解决的问题之一。Siritunga等[29]以CaMV35S启动子驱动羟基裂解酶（HNL）在木薯品种Co12215中过表达，块根CG总量不变，但块根中HNL则提高达800%～1 300%，采后脱毒能力大幅提高。Abhar等利用马铃薯糖蛋白驱动子和启动子改良木薯品种TMS60444块根蛋白含量，结果表明，转基因木薯叶和根茎氰化物含量均降低近55%，为研究改良木薯氰化物含量提供了新的思路[30]。

此外，提高木薯淀粉含量和改变直链/支链淀粉比例也是研究热点。木薯块根鲜样淀粉含量一般为24%～32%，干样淀粉含量为73%～83%，且木薯淀粉中有支链和直链淀粉2种形式，其中直链淀粉约占17%、支链淀粉占83%。Ihemere等[31]以木薯品种TMS71173为转化材料，利用马铃薯块茎特异启动子patatin驱动大肠杆菌glgC（G336D）进行转化，结果显示，木薯块根中淀粉含量增加近3倍，同时AGPase活性提高70%。

3.2    抗病抗除草剂基因工程

木薯常见病虫害包括病毒类的木薯褐条病（CBSD）、细菌性枯萎病（CBB）、木薯花叶病（CMD）、角斑病等。Thresh等[32]调研显示，在非洲褐条病导致的木薯减产幅度可达35%，局部地区甚至高达70%。Yadav等[33]在木薯品種TMS60444以CBSUV外壳蛋白基因全长为靶目标，通过RNA干扰技术，形成发夹结构抑制靶基因在木薯中的表达，获得了完全抵抗木薯褐条乌干达病毒（CBSUV）的抗性木薯。Pita等[34]将ACMV复制酶基因AC1导入木薯品种TMS60444，获得了ACMV抗性木薯，同时对其他常见病毒也具有一定抵抗能力。Ntui等[35]利用木薯品种KU50构建RNA干扰载体转化载体，获得抗斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV）木薯。另外，参考草甘膦和草丁膦在其玉米、大转基因方面的应用，通过转基因技术赋予木瓜抗除草剂特性，可有效除去田间杂草，实现高产低耗的效应。Sarria等[36]首次尝试以木薯品种MPerl83为载体，将草丁膦抗性基因bar导入其中，获得的3个转化株系，均对草丁膦产生一定的抗性作用。

3.3    抗逆基因工程

木薯的育种目标始终是选育高产稳产、耐寒、适应性广、抗逆性强的优良品种。木薯对冷害敏感，不耐低温和霜冻，因而木薯品种的耐寒性强弱直接关系到木薯产量的高低。陈松笔等[37]以木薯品种TMS60444为载体，将APX和Cu/ZnSOD共表达载体转化其中，结果显示，转化株系的耐寒性得到提高，APX酶和SOD酶活性较对照均不同程度提高。李  筠等[38]在木薯中同时导入Cu/ZnSOD和APX，结果显示，在干旱胁迫条件下具有较强的活性氧清除能力，叶片含水量和耐寒性得到提高。王  燕等[39]通过农杆菌介导向木薯西选03中转入抗逆性基因，从而增强木薯的抗逆性，减轻自然灾害的危害程度。王  颖等[40]将蔗糖果糖基转移酶1-SST基因导入木薯品种SC6中，结果表明，转基因阳性单株的抗逆性大大增加。

4    展望

现代生物技术已经在木薯育种中得到迅速发展。相对于传统的资源引进的育种方法，诱变育种具有操作性强、突变率高等特点，但变异不定向，需大田田间表型鉴定公司鉴定。而分子标记辅助选择育种是实施定向设计育种，具有周期短、效率高等特点，但需要依据已知基因和表型性状优良的抗性资源。转基因育种具有快速定向培育新种质资源的优势，具有抗虫、抗除草剂性状，适合绿色农业发展，但同时需严格遵守国家转基因法律法规监管和限制释放[41]。为保障国家粮食安全，满足国内对木薯淀粉的需求，在较短时间内培育出淀粉含量高、抗逆性强、食用安全的木薯新品种，可在常规育种技术的基础上，利用现代生育育种技术，建立高效的木薯综合育种技术方法。

5    参考文献

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