广西猪圆环病毒2型全基因扩增及来源分析

薛新绵

摘要：某猪场发生疫情，通过聚合酶链反应（PCR）检测、扩增猪圆环病毒2型（PCV2）GX-20全基因序列，通过与国内外毒株同源性比对、绘制系统发育进化树，发现GX-20与广东、湖南、贵州和山东等周边省份同源性较高，且高于历年分离的广西流行毒株，结合引种情况，推测GX-20是由于引种从广东传播到广西。

关键词：猪圆环病毒2型;全基因扩增;来源

中图分类号：$852.65⁺1 文献标识码：B文章编号：2095-9737（2020）06-0008-02

猪圆环病毒2型（poreine circovirus type 2，PCV2）是猪圆环病毒相关疾病（PCV2-associateddiseases，PCVAD）的主要病原，该病是严重危害全球养猪业的猪场重要传染病，每年给我国造成巨大经济损失。PCV2是无囊膜的单股环状负链DNA病毒，全长约1800bp，包含5个开放阅读框，编碼Rep、Rep、Cap等蛋白。根据病毒全基因组和Cap基因，可将PCV2分为8个基因型，其中PCV2a、PCV2b、PCV2d在全球广泛流行。2010年我国检出的PCV2变异毒株属于PCVgd亚型。

作者在发病猪群中检出PCV2，通过扩增其全基因、与国内外毒株进行同源性比对，结合生产实际，推测该病毒来源，为掌握近年来广西PCV2流行和变异、掌握病毒遗传进化以及致病机理的研究提供数据参考。

1材料和方法

1.1材料

pMD18-T载体、大肠杆菌DH5a、LA TaqMix、LB培养基、DNA抽提试剂盒等试剂分别购自Takara公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2样品采集、抽提及PCV2全基因扩增

发病猪组织样品来源于本地某猪场，采集猪肺脏、淋巴结、脾脏和肝脏。将组织样品与无菌PBS按照1：4混合、研磨制成匀浆，冻融3次后，离心取上清，用于抽提基因组DNA。以基因组DNA为模板，进行PCV2全基因扩增。引物及反应条件（表1）、反应体系参考文献。

1.3DNA片段纯化、克隆和测序

PCR产物经1%琼脂糖电泳后，参考胶回收试剂盒说明书，回收、纯化目的片段，4℃连接pMD-18T过夜，按照文献介绍的方法，转化DH5a感受态细胞，涂布LB平板，培养过夜后，挑取单个菌落，接种于LB培养基，按照质粒DNA小量提取试剂盒说明书抽提质粒，鉴定后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。

1.4同源性分析及病毒来源

运用DNAStar对获得的PCV2全基因序列进行同源性分析，结合国外及国内各省获得的PCV2毒株序列，构建系统进化树，用于分析病毒来源。

2结果与分析

2.1PCV2全基因扩增

利用特异性引物扩增出约1767bp基因片段（图1），与预期目的基因大小相符。将该毒株命名为GX-20。

2.2PCV2全基因序列测定与分析

GX-20的PCV2全基因扩增片段经克隆、测序后，获得全长1767bp序列。利用DNAStar分析其与3株国外PCVl毒株和19株国内PCV2毒株的同源性。发现GX-20与19株国内毒株全基因核苷酸序列同源性为95.2%～98.8%，最低的是GXGG毒株，最高的是GD毒株;与7株广西周边省份PCV2毒株（GY06、GD-zl、GD、GD-TS、HN07、HN10、AH05）全基因核苷酸序列之间的同源性为96.8%～98.8%，最低的是AH05毒株，最高GD毒株;与10株广西PCV2毒株（GXGW、GXHK、GXHP、GX、GXWZ、GXLC、GXHZ-1、GXHZ-2、GXGG、GXZZ）之间的同源性为95.2%～98.7%，同源性最低为GXGG毒株，最高为GXHP毒株;与3株国外PCVl毒株之间全基因核苷酸序列的同源性为76.4%～77.O%。

根据同源性比对，绘制PCV2系统进化树（图2），可见：PCV分成PCV1、PCV2两大分支，3株PCVl毒株形成PCV1分支，其他20株PCV2毒株形成PCV2分支。而PCV2分支又分为两支，其中GXGG单独位于一个分支，其他19株位于另一个分支。本研究的GX-20与3株广东株（GD、GD-TS、GD-ZJ）、4株广西株（GXWZ、GXZZ、GXHP、GXGW）、1株湖南株、1株山东株、1株贵阳株亲缘关系较近，其中与GD株亲缘关系最近，与广西株（GXHZ-1、GXHZ-2、GXGG）亲缘关系较远。结合发病猪群是近日从广东引种来到广西，因此，推测GX-20随着引种由广东传播到广西。

3小结

广西是我国畜牧养殖业大省，PCV2是阻碍广西养猪业发展的重要疫病，每年造成巨大经济损失;而且PCV2感染可致机体免疫抑制，降低机体免疫水平，导致其他病原的继发感染，给疫病防控带来巨大挑战，因此是养猪业重点监测对象。

近日，从发病猪群中检出PCV2病毒，通过全基因扩增、克隆、测序、分析等发现，该毒株与广东、湖南、贵州、山东等省分离株同缘关系较近，与广西分离株同源关系较远，结合引种，推测该毒株是由广东传播到广西。因此，应加强今后引种过程中疫病防控。