亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素影响猪链球菌生物被膜形成和毒力因子表达的研究

王嘉怡，刘宝宝，张港琛，李金朋，毛晨龙，樊擎莹，汪 洋

（河南科技大学 动物科技学院/洛阳市畜禽分子病原与免疫学重点实验室，河南 洛阳 471003）

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种重要的人畜共患病病原体。猪体带菌率接近100%，致死率将近20%[1]。SS 能够粘附于宿主细胞外的基质蛋白，包括纤连蛋白和胶原蛋白，同时也能粘附于宿主内皮细胞和上皮细胞上而造成持续性感染。SS 已被证实能够形成生物被膜状态，而体内细菌的生物被膜状态也可能是其引起持续感染的原因之一[2]。细菌生物被膜（Biofilm，BF）是细菌粘附于异物或组织表面，通过分泌多糖基质、纤维蛋白等复合物使细菌相互黏连、聚集，形成立体膜样结构，是细菌微菌落聚集体。细菌生物被膜状态被认为是细菌适应恶劣环境而形成的一种保护模式，导致其对抗生素及宿主的免疫反应不敏感[3]。

强力霉素和庆大霉素是用于预防和治疗SS 感染最有效的抗生素，但由于口服吸收率低和药物本身代谢动力学原因，其通常在猪体内以低于其对SS 的最小抑菌浓度（即亚抑菌浓度）水平存在[4]。研究表明亚抑菌浓度抗生素可以作为信号分子诱导细菌生物被膜的形成，同时通过降低细菌毒力因子表达来利于其生存[5]。SS 最常见的关键毒力因子有荚膜多糖（CPS）、胞外因子（EF）、溶血素（SLY）、纤连蛋白结合蛋白（FBPS）、谷氨酸脱氢酶（GDH）和磷酸甘油醛脱氧酶（GAPDH）[6]。亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素是否会影响SS 生物被膜的形成和毒力因子的表达尚未见报道。基于此，本研究对亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素作用下SS 生物被膜形成能力和毒力因子转录水平进行了初步研究，以期为临床正确使用抗生素防止细菌感染提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料SS9801菌株（SS）是1998 年从江苏省淮安县某猪场感染猪中分离，具有良好的生物被膜形成能力，保存于含有20%甘油的TSB 培养基中，-20 ℃保存。

强力霉素和庆大霉素购自中国兽医药品监察所，并根据含量均制备成浓度为1 280 μg/mL；TSB（Todd-Hewitt Broth）培养基购自美国BD 公司；TRIzol和反转录试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 强力霉素和庆大霉素对SS 的最小抑菌浓度（MIC）测定根据美国临床检验标准委员会（CLSI）规定的二倍稀释法测定强力霉素和庆大霉素对SS 的MIC[7]。

1.3 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 生物被膜形成能力影响的检测将TSB 液体培养基中的SS在37 ℃培养至终浓度为106cfu/mL，然后加入96 孔板中，再分别加入1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 强力霉素或庆大霉素于96 孔板中，以不加抗生素的孔为阴性对照，每组3 个重复，培养24 h 后用移液枪吸去浮游态SS，PBS 洗涤两次，加入95%甲醇固定5 min 后每个孔加入200 μL（10%w/w）结晶紫，室温染色10 min，风干后加入200 μL 95%乙醇，5 min 后，检测各组OD570nm值，根据该值分析SS生物被膜形成能力。

1.4 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 生长影响的测定按1.4 方法加入相同浓度强力霉素或庆大霉素后将SS 在96 孔培养板中37 ℃培养，每小时取1 mL 培养菌液，测定OD600nm，绘制亚抑菌浓度培养条件下SS 的生长曲线。

1.5 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 生物被膜内活菌数影响的测定根据Andreia 等的方法对亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素作用下的生物被膜内SS 活菌数量进行测定[8]。按1.4 的方法培养SS 后加入96 孔板中，再分别加入1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 强力霉素或庆大霉素，以不加抗生素的孔为阴性对照，每组3 个重复，培养24 h。用移液枪去除浮游态SS，加入100 μL PBS 冲洗3 次后，每孔加入100 μL PBS，在超声波水浴中间断性超声1 min，共处理10 次以破碎SS 生物被膜并保证被膜下SS 细胞的完整性[8]。将粘附于96 孔板孔壁和孔底的SS 的细胞重悬于PBS 中，二倍稀释后在TSB固体培养基37 ℃培养24 h 后计数。

1.6 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 生物被膜形成的形态观察根据1.6 所得结果将SS 分别于含有1/4 MIC 和1/8 MIC 强力霉素或1/2 MIC 和1/4 MIC 庆大霉素的2 mL TSB 培养基中过夜培养后，按照1:100转接至带有爬片的24 孔板中，37 ℃培养36 h[9]，将爬片取出固定到载玻片上，用去离子水冲洗3 次，革兰染色后镜检观察SS 分布状态。

1.7 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 毒力因子影响的检测分别将1/4 MIC 和1/8 MIC 强力霉素或庆大霉素加到SS 菌液中， 37 ℃培养8 h，同时设不添加抗生素做阴性对照。利用TRIzol 法分别提取各组SS 的总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，采用qRT-PCR 检 测 后 利 用（2-ΔΔCT）方 法计 算 毒力 因 子cps、ef、sly、fbps、gdh和gapdh的转录水平[10]。反应条件为：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 个循环。引物信息详见表1。

表1 用于qRT-PCR 扩增的毒力因子的引物Table 1 Primers used for the qRT-PCR analysis

1.8 统计分析所有数据用±s 表示，并且使用SPSS 22.0 对数据进行统计分析。各试验均以未添加抗生素作为阴性对照组。数据利用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05 具有统计学意义。

2 结 果

2.1 强力霉素和庆大霉素MIC 的测定结果经二倍稀释法测定强力霉素对SS 的MIC 为5 μg/mL；庆大霉素对SS 的MIC 为10 μg/mL。

2.2 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 形成生物被膜影响的测定结果在SS 中分别添加不同亚抑菌浓度的强力霉素和庆大霉素，经结晶紫法测定SS的生物被膜形成能力。结果显示，未添加抗生素的SS 的OD570nm平均值为0.29，添加1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 强力霉素后，SS OD570nm平均值分别为0.31、0.35、0.32 和0.33，明显大于未添加抗生素的SS OD570nm值（p<0.05）；1/2 MIC 和1/4 MIC 庆大霉素作用下的SS 的OD570nm平均值分别为0.32 和0.34，SS 生物被膜形成能力明显增强（p<0.01）。而1/8 MIC和1/16 MIC 庆大霉素作用下SS 的OD570nm平均值分别为0.290 和0.30，对SS 的生物被膜形成无影响（图1）。结果表明在亚抑菌浓度强力霉素（1/2 MIC～1/16 MIC）或庆大霉素（1/2 MIC 和1/4 MIC）作用下，SS 生物被膜形成能力均增强。

图1 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 生物被膜形成能力影响的检测结果Fig.1 Effect of sub-MICs of doxycycline or gentamicin on biofilm formation of SS

2.3 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 生长影响的测定结果在培养SS 的96 孔板中分别加入不同亚抑菌浓度的强力霉素或庆大霉素，每1 h 取培养液测定OD600nm值绘制SS 的生长曲线。结果显示，分别在1/2 MIC～1/16 MIC 强力霉素作用下，SS 的生长与未添加抗生素相比其前期生长受到抑制，生长速率减缓，但随着培养时间延长，其生长逐渐恢复（图2A）。分别在1/4 MIC、1/8 MIC 或1/16 MIC 庆大霉素作用下，SS 生长曲线与未添加抗生素相比其前期生长速度减慢；在1/2 MIC 庆大霉素作用下，SS 的前期生长明显受到抑制，但随着培养时间的延长其生长逐渐恢复（图2B）。结果表明不同亚抑菌浓度的强力霉素或庆大霉素均减缓了SS 的生长速率，但随着培养时间延长，其生长逐渐恢复。

图2 亚抑菌浓度的强力霉素（A）和庆大霉素（B）作用下的SS 生长曲线（n=3，±s）。Fig.2 Growth curves of SS at the sub-MICs of doxycycline(A)and gentamicin(B)(n=3,±s)

2.4 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 被膜内活菌数影响的测定结果采用活菌计数法对不同亚抑菌浓度的强力霉素或庆大霉素作用下的生物被膜内SS 活菌数量进行测定。结果显示，分别在1/4 MIC 和1/8MIC 强力霉素作用下，SS 生物被膜内活菌数量与未添加抗生素对照相比显著增加（p<0.001），而分别在1/2 MIC 和1/16MIC 强力霉素作用下SS 生物被膜内的活菌数量变化不明显；在1/2 MIC 和1/4 MIC 庆大霉素作用下，SS 生物被膜内活菌数量与未添加抗生素对照相比显著增加（p<0.001），而分别在1/8 MIC 和1/16 MIC 庆大霉素作用下SS 生物被膜内活菌数量变化不明显（图3）。表明1/4 MIC 和1/8 MIC强力霉素或1/2MIC 和1/4MIC 庆大霉素均增加了生物被膜内SS 的活菌数量。

2.5 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 生物被膜形成的形态观察分别在1/4 MIC 和1/8 MIC 强力霉素或分别在1/2 MIC 和1/4 MIC 庆大霉素中培养SS后，经革兰染色后镜检。结果可见，当加入上述浓度的强力霉素或庆大霉素时，经显微镜均能观察到明显的SS 集聚成团现象，而未添加抗生素的SS 则集聚不明显（图4）。表明亚抑菌浓度的强力霉素或庆大霉素均能够促进SS 形成聚集状态利于其生物被膜的形成。

图3 亚抑菌浓度强力霉素和庆大霉素对SS 生物被膜中活菌数影响的检测结果Fig.3 Effect of sub-MICs of doxycycline or gentamicin on viable cell counts of SS in biofilm

图4 1/4 MIC 和1/8 MIC 强 力 霉 素 或1/2 MIC 和1/4 MIC庆大霉素素对SS 分布状态的影响观察结果（100×）Fig.4 Effect of 1/4 MIC and 1/8 MIC of doxycycline or 1/2 MIC and 1/4 MIC gentamicin on the SS distribution state(100×)

2.6 亚抑菌浓度强力霉素或庆大霉素对SS 毒力因子转录水平的检测结果将SS 分别置于1/4 MIC 和1/8 MIC 强力霉素或分别置于相同浓度的庆大霉素中培养8 h 后，提取各组SS 总RNA 反转录后，采用qRT-PCR 检测各组SS 的毒力因子转录水平。结果显示，当分别添加1/4MIC 和1/8MIC 的强力霉素或庆大霉素时，SS 毒力因子cps、ef、sly、fbps、gdh 和gap⁃dh 的转录水平与未添加抗生素的SS 毒力因子相比均显著下降（p<0.01）（图5）。表明亚抑菌浓度的强力霉素或庆大霉素均能够抑制SS 毒力因子的转录水平。

图5 1/4 MIC 和1/8 MIC 强力霉素或庆大霉素对SS 毒力因子转录水平影响的检测结果Fig.5 Effect of 1/4 MIC and 1/8 MIC of doxycycline or gentamicin on transcription levels of virulence factors of SS

3 讨 论

近年来，在动物饲养和治疗过程中滥用抗生素现象越来越严重，已经导致多重耐药菌株的出现和传播。早期预防或者治疗畜禽相关细菌病最常用的方法是将抗生素添加到水或饲料以口服的方式摄取，但由于药代动力学等原因，抗生素大多以低于其最低抑菌浓度（即亚抑菌浓度）存在于动物体内[11]。研究表明亚抑菌浓度抗生素可以增强细菌生物被膜的形成能力从而造成其持续性感染[12]。SS 在猪体内常以生物被膜形式定植生存，导致感染反复且难以控制[13]。亚抑菌浓度抗生素对SS 生物被膜形成能力和毒力因子的影响很少有文献报道。强力霉素和庆大霉素在预防SS 感染中常以亚抑菌浓度作为饲料添加剂[14-15]。因此，探究亚抑菌浓度强力霉素和庆大霉素对SS 生物被膜形成能力和毒力因子转录水平的影响，可以对临床正确使用该类抗生素防止细菌持续性感染提供参考依据。

本研究首先检测亚抑菌浓度的强力霉素和庆大霉素对SS 生物被膜形成能力的影响。结果表明1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 和1/16 MIC 的强力霉素和1/2 MIC、1/4 MIC 的庆大霉素均提高了SS 生物被膜形成能力。生长动力学结果显示，不同亚抑菌浓度的强力霉素或庆大霉素均减缓了SS 的生长速率，但随着培养时间延长，其生长特性恢复。Haas 等人利用亚抑菌浓度阿莫西林处理的SS P1/7 株具有类似的生长模式，这种生长模式可能有助于促进SS 生物被膜的形成[16]。基于此，本研究进一步探究不同亚抑菌浓度的强力霉素和庆大霉素对SS 生物被膜活菌数量影响，结果表明，在亚抑菌浓度强力霉素（1/4 MIC 和1/8 MIC）或庆大霉素（1/2 MIC 和1/4 MIC）作用下生物被膜内SS 活菌数量明显增加。经显微镜观察在此浓度作用下，SS 集聚程度也均明显增加。以上结果表明亚抑菌浓度的强力霉素和庆大霉素可以增强SS 生物被膜的形成能力。

Bruchmann 等观察到亚抑菌浓度的抗生素能够增加细菌生物被膜的生物量和厚度，同时诱导生物被膜结构发生变化从而影响生物被膜中细菌的致病能力[17]。刘湛军等的研究表明亚抑菌浓度抗生素可以作为信号分子发挥作用，如诱导紫色杆菌毒力因子表达，形成生物被膜和调控菌群密度感应系统[18]。Ahmed 等的研究表明在亚抑菌浓度四环素作用下，肺炎链球菌中生物被膜形成能力和被膜内活菌数增加，可能受到LuxS/AI-2 密度感应系统的调控[19]。Mlynek 等的研究表明亚抑菌浓度阿莫西林可以诱导金黄色葡萄球菌细胞外基因（eDNA）的表达，从而刺激其生物被膜的形成[20]。本研究亚抑菌浓度的强力霉素和庆大霉素增强SS 生物被膜形成能力的机制推测可能也是通过密度感应系统信号传导途径或通过诱导相关基因的表达来实现的，但具体的调控机制还需要进一步研究。

在前期培养阶段发现，在1/2 MIC 庆大霉素作用下SS 的活菌数量受到影响，但1/4 MIC 和1/8 MIC强力霉素或庆大霉素对其生长无影响。因此本研究选择1/4 MIC 和1/8 MIC 强力霉素或庆大霉素探究其对SS 毒力因子转录水平的影响。结果显示，在此浓度的强力霉素或庆大霉素作用下，SS 毒力因子cps、ef、sly、fbps、gdh 和gapdh 转录水平均显著下调，这些毒力因子在SS 感染和侵袭中起重要作用，其转录水平下调可能会降低SS 的毒力和致病性，从而形成其的持续性感染[21]。但具体的调控机制有待进一步探究。

综上所述，本研究结果表明亚抑菌浓度的强力霉素和庆大霉素可以增强SS 生物被膜形成能力和降低其毒力因子的转录水平从而形成其持续性感染，本研究为正确合理使用抗生素提供参考依据。