外周血循环肿瘤细胞联合CA153检测在乳腺癌筛查及分期预测中的应用价值*

邱晓阳， 吴 璇， 刘 君， 詹晓芬， 陈志强

1广东省汕头市中心医院病理科，汕头 5150312中山大学附属肿瘤医院病理科，广州 5100603南方医科大学附属中山市博爱医院病理科，中山528400

乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病率的首位，全世界每年约有120万新发病例、50万死亡病例。我国2015年新发病例约为27.2万，7万例死亡病例[1]。乳腺癌患者5年生存率仅为20%，大约10%的患者在首次就诊时就已发生了转移[2]。Da Costa Vieira等[3]研究显示：对于发展中国家，早期的乳腺癌筛查是降低死亡率、有效提高生存率最有效的方法。乳腺X线摄影是目前临床上常用的筛查手段，但是其辐射性影响及灵敏度低等问题仍然存在诸多争议[4]。目前，临床上仍然没有一种公认的无创筛查最佳组合模式。

外周血循环肿瘤细胞(CTC)是近年来悄然兴起的一种检测技术。其无创、特异的优点吸引了国内外越来越多医学实验室的关注。周斌等[5]、Fehm等[6]研究报道：CTC对于乳腺癌的早期筛查、疗效监测及预后评估具有较好的预测价值，但其敏感度仍然较低。杨泽安等[7]研究认为：糖类抗原153(CA153)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)对于乳腺癌的筛查、术后随访、复发转移均具有一定的临床价值，尤以CA153的灵敏度、准确度、阳性预测值及特异度最好，是最有价值的单项诊断指标。

本研究拟初步探讨外周血循环肿瘤细胞联合CA153检测在乳腺癌筛查及分期预测中的应用价值，以期获得乳腺癌无创的血液学筛查指标最佳组合模式。

1 资料与方法

1.1 研究对象

使用抽签法随机选取2016年5月至2019年1月期间，于汕头市中心医院、中山大学附属肿瘤医院、南方医科大学附属中山市博爱医院就诊的185例健康体检者(对照组)、163例乳腺良性病变患者(良性组)、139例乳腺癌患者(恶性组)作为受试者，抽取受试者3.2 mL静脉血并检测其治疗前CTC和CA153水平。受试者均为女性、经临床多学科证实，未发现有其他肿瘤。对照组：年龄23.6～82.3岁，平均年龄(42.6±7.9)岁；良性组：年龄22.8～77.6岁，平均年龄(41.9±8.3)岁；恶性组：年龄25.3～78.9岁，平均年龄(43.8±8.6)岁。经方差分析，3组受试者年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得患者知情同意。

恶性组病例的纳入标准根据2012年第4版《WHO乳腺肿瘤组织学分类》标准执行[8]。恶性组的临床分期依据AJCC第8版乳腺癌分期执行，分为：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期[9]。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂及仪器 糖类抗原CA153测定试剂盒和COBAS E601分析仪均为罗氏诊断产品有限公司生产。人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒为江苏莱尔生物医药科技有限公司生产。NIKON ECLIPSE 80 i共聚焦荧光显微镜为尼康仪器(上海)有限公司生产。

1.2.2 CA153检测及判定标准 采用COBAS E601分析仪检测CA153水平，使用PreciControl Tumor Marker进行质量控制，每次更换试剂或者定标后必须进行质控。按照CA153检测说明书提供的参考值为26.4 U/mL。本文将CA153≥26.4 U/mL的检测结果定义为阳性；反之，将CA153<26.4 U/mL的检测结果定义为阴性。

1.2.3 CTC富集、鉴别过程及判定标准 使用阴性富集CTC技术和免疫荧光原位杂交(imFISH)CTC鉴别技术实现CTC富集与鉴别。具体的操作流程参考相关文献[10]：抽取3组受试者3.2 mL静脉血，放入含有0.8 mLACD抗凝管中摇匀，实现血浆分离，进行红细胞溶解、白细胞剔除，涂片晾干后进行imFISH，将标本置于荧光显微镜20倍物镜下，按照“S”型扫描整张涂片，若发现可疑阳性信号，则切换到40倍物镜下进行确认。CTC判定标准：有细胞核即DAPI阳性，CEP8/17双探针检测细胞核内任意一种颜色FISH信号点>2个，白细胞表面抗原CD45阴性表达的细胞(图1)。按照厂家提供的试剂说明书，若患者CTC数目≥2个，定义为患者CTC阳性。反之，患者CTC数目<2个，定义为患者CTC阴性。

A：白细胞表面抗原CD45阴性表达；B：CEP8/17双探针中的CEP8探针信号数为4个；C：CEP8/17双探针中的CEP17探针信号数为4个；D：肿瘤细胞核(DAPI蓝色)；E：为图A、B、C、D合成的CTC图片图1 CTC判定标准(×1000)Fig.1 CTC criteria(×1000)

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 乳腺癌患者CEP8/17组合探针扩增型CTC图像

荧光显微镜下，乳腺癌患者CEP8/17组合探针扩增型CTC表现为：CEP8单染色体扩增型CTC、CEP17单染色体扩增型CTC和CEP8/17双染色体扩增型CTC。扩增型CTC的探针信号数从3个到数十个不等。图中蓝色部分区域为肿瘤细胞核所在位置，橙色信号点为CEP8探针信号所在位置，绿色信号点为CEP17探针信号所在位置。见图2。

2.2 CTC、CA153及联合检测在3组受试者中的阳性率比较

CTC、CA153及联合检测在3组受试者中的阳性率总体差异均具有统计学意义(均P<0.05)。恶性组的CTC、CA153及联合检测阳性率均为最高，与对照组、良性组相比，差异均具有统计学意义(均P<0.01)；CTC、CA153及联合检测阳性率在对照组与良性组之间差异均无统计学意义(P=0.13，P=0.11，P=0.06)。见表1。

表1 CTC、CA153及联合检测在3组受试者中的阳性率比较[例(%)]Table 1 Comparison of the positive rates of CTC，CA153 and combined detection among the three groups[cases(%)]

2.3 CTC、CA153及联合检测在3组受试者中的检测值比较

3组间CTC数量的方差不具有齐性(F=328.37，P<0.05)，采用非参数检验。3组间CTC数量的总体差异具有统计学意义(H=401.41，P<0.05)。进一步行多重比较：恶性组的CTC数量最高，与对照组、良性组相比，差异均具有统计学意义(均P<0.01)；对照组与良性组之间的CTC数量差异无统计学意义(P=0.13)。见表2。

A1：CEP8三体；A2：CEP8四体；A3：CEP8多体；B1：CEP17三体，B2：CEP17四体，B3：CEP17多体；C1：CEP8三体+CEP17三体，C2：CEP8四体+CEP17多体，C3：CEP8多体+CEP17多体图2 乳腺癌患者CEP8/17组合探针扩增型CTC图像(×1000)Fig.2 Expanded CTC images of breast cancer patients with CEP 8/17 combined probe(×1000)

3组间CA153数值的方差不具有齐性(F=58.95，P<0.05)，采用非参数检验：3组间CA153数值的总体差异具有统计学意义(H=254.26，P<0.05)。进一步行多重比较：恶性组的CA153数值最高，与对照组、良性组相比，差异均具有统计学意义(均P<0.01)；对照组与良性组之间的CA153数值差异无统计学意义(P=0.07)。见表2。

表2 CTC、CA153及联合检测在3组受试者中的检测值比较[M(P25，P75)]Table 2 Comparison of CTC，CA153 and combined detection in screening three groups of subjects[M(P25，P75)]

2.4 CTC、CA153及联合检测在恶性组各临床分期中的阳性率比较

恶性组各期CTC的阳性率总体差异具有统计学意义(χ2=18.16，P<0.05)。进一步行多重比较：I与Ⅲ期、I与Ⅳ期之间CTC阳性率差异具有统计学意义(均P<0.01)；I与Ⅱ期(P=0.08)、Ⅱ期与Ⅲ期(P=0.29)、Ⅱ期与Ⅳ期(P=0.03)、Ⅲ期与Ⅳ期(P=0.29)之间CTC阳性率差异无统计学意义。

恶性组各期CA153的阳性率总体差异具有统计学意义(χ2=26.52，P<0.05)。进一步行多重比较：I与Ⅲ期、I与Ⅳ期、Ⅱ与Ⅳ期之间CA153阳性率差异具有统计学意义(均P<0.01)。I与Ⅱ期(P=0.16)、Ⅱ期与Ⅲ期(P=0.02)、Ⅲ期与Ⅳ期(P=0.50)之间CA153阳性率差异无统计学意义。

恶性组各期联合检测的阳性率总体差异具有统计学意义(χ2=33.90，P<0.05)。进一步行多重比较：I与Ⅱ期、I与Ⅲ期、I与Ⅳ期患者之间联合检测阳性率差异具有统计学意义(均P<0.01)。Ⅱ期与Ⅲ期(P=0.30)、Ⅱ期与Ⅳ期(P=0.25)、Ⅲ期与Ⅳ期的联合检测阳性率均为100%，差异无统计学意义。见表3。

表3 CTC、CA153及联合检测在恶性组各临床分期中的阳性率比较[例(%)]]Table 3 Comparison of the positive rates of CTC，CA153 and combined detection in different clinical stages of malignant group[cases(%)]

2.5 CTC、CA153及联合检测在恶性组各临床分期中的检测值比较

恶性组各期CTC数量方差不具有齐性(F=7.59，P<0.01)。采用非参数检验：恶性组各期CTC数量的总体差异具有统计学意义(H=358.67，P<0.05)。进一步行多重比较：恶性组Ⅳ期的CTC数量最高，各期之间的CTC数量差异具有统计学意义(均P<0.01)。

恶性组各期CA153数值方差不具有齐性(F=3.25，P=0.02)。采用非参数检验：恶性组各期CA153数值的总体差异具有统计学意义(H=23.12，P<0.01)。进一步行多重比较：恶性组Ⅳ期的CA153数值最高，除I与Ⅱ期、I与Ⅲ期、I与Ⅳ期患者间CA153数值差异有统计学意义(均P<0.01)外，Ⅱ期与Ⅲ期(P=0.27)、Ⅱ与Ⅳ(P=0.54)、Ⅲ期与Ⅳ期患者(P=0.51)间CA153数值差异均无统计学意义。见表4。

表4 CTC、CA153及联合检测在恶性组各临床分期中的检测值比较[M(P25，P75)]Table 4 Comparison of detection value of CTC，CA153 and combined detection in different clinical stages of malignant group[M(P25，P75)]

2.6 CTC、CA153及联合检测对乳腺癌诊断效能的比较

以组织病理学诊断为金标准，分析3种检测方法对乳腺癌的诊断效能，联合检测的灵敏度、符合率、阴性预测值均较CTC、CA153检测高，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。而联合检测的特异度、阳性预测值与CTC、CA153检测差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表5。

表5 乳腺癌患者CTC、CA153及联合检测诊断效能的比较(%)Table 5 Comparison of diagnostic efficacy of CTC，CA153 and combined detection in patients with breast cancer(%)

2.7 CTC与CA153联合检测的Logistic回归模型

表1及表2试验数据显示：CTC及CA153均为乳腺癌发生的独立危险因素。因此，本文以是否为乳腺癌为因变量，以CTC及CA153检测结果为自变量，拟合CTC与CA153联合检测的Logistic回归模型：Ln(P/1-P)=-3.213+0.298×CTC+0.066×CA153。见表6。

表6 联合检测的Logistic回归分析参数估计值和Wald检验结果Table 6 Logistic regression analysis parameter estimation and Wald test results of joint detection

2.8 CTC、CA153及联合检测对乳腺癌的诊断价值比较

以上述Logistic回归模型的P值构建联合检测的ROC曲线，绘制CTC、CA153及联合检测的ROC曲线后进行3种检测方法诊断价值的比较。CTC的AUC为0.754(95%CI：0.691～0.816)，CA153的AUC为0.719(95%CI：0.661～0.778)，联合检测的AUC为0.838(95%CI：0.796～0.880)。联合检测的AUC大于CTC、CA153检测，差异具有统计学意义(均P<0.05)，而CTC与CA153之间AUC差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 CTC、CA153及联合检测对乳腺癌的ROC曲线分析Fig.3 ROC curve analysis of CTC，CA153 and combined detection in breast cancer

3 讨论

据国家癌症中心2019年最新癌症报告显示：乳腺癌仍然是威胁我国女性生命健康的主要恶性肿瘤之一，乳腺癌早期症状和体征不明显，容易被忽视，整体的防控形势仍然十分严峻。Coleman等[11]研究显示：乳腺癌患者血液中既有肿瘤标志物也有循环肿瘤细胞，早期的乳腺癌筛查对于患者的治疗及预后有重要意义。传统观点认为CA153是筛查乳腺癌较好的肿瘤标志物，而现代医学发现CTC作为细胞染色体形态学指标对多癌种的筛查均具有一定的临床意义。但是，CA153和CTC单项检测对乳腺癌的筛查价值有限，目前临床上缺乏乳腺癌筛查方法的最佳组合模式。本研究通过综合评估CTC、CA153、二者联合检测对乳腺癌的诊断效能和诊断价值，探讨一种无创、高效、便捷的乳腺癌筛查方法。

CTC是从原发肿瘤自发脱落或因医疗操作后进入脉管系统的肿瘤细胞。Mohme等[12]研究显示：CTC可在形成实体瘤病灶之前进入脉管系统，有可能早于影像学发现或临床症状。陈志强等[13]研究认为：通过检测患者的CTC，有助于卵巢癌的早期诊断及分期预判。本文之所以采用特异性的CEP8/17组合探针，主要原因是：恶性组受试者中8号及17号染色体异常表达情况较为普遍，而8号及17号染色体异常表型与乳腺癌的异常增殖相关，是细胞癌变的特征指标，与Mohme等[12]的研究报道一致。

荧光显微镜下乳腺癌患者扩增型CTC呈现出CEP8单染色体扩增型CTC、CEP17单染色体扩增型CTC、CEP8/17双染色体扩增型CTC，说明CEP8/17组合探针较单探针CEP8或CEP17而言，进一步提高了检测的灵敏度和阴性测预值，使乳腺癌的诊断效能得到了提升。本文通过检测CEP8/17组合探针，标记了不同的染色体扩增，可提前反映出乳腺癌细胞的独特生物学特征，而染色体的异常早于细胞形态的异常，因此，可以指导临床对乳腺癌的诊断及分期预测。

表1、表2分别反映了CTC在对照组、良性组和恶性组中阳性率及数量的差异，说明了CTC阳性率及数量跟乳腺癌相关，可以作为乳腺癌筛查靶标，与Bahnassy等[14]研究结论一致。至于文中CTC之所以在良性组患者中出现，作者认为：某些乳腺良性病变，如乳腺普通导管增生性病变，是一种以形成二级管腔和中央增生细胞呈水流样分布为特征的良性导管增生，尽管它不是一种癌前病变，但长期随访认为它与乳腺癌发生相关，其过度增生的癌变细胞有可能以CTC的形式不再受限于乳腺导管小叶系统而进入间质中，因而被检测出来。表3、表4则分别反映了CTC在恶性组各期患者的阳性率及数量差异，说明了CTC与乳腺癌AJCC分期相关，可作为临床分期重要的参考指标，与单海琳等[15]研究报道CTC与乳腺癌临床分期相关的结论一致。事实上，第8版乳腺癌AJCC分期系统的更新内容就肯定了CTC对乳腺癌诊治及分期的临床意义[16]。

CA153是传统的乳腺癌筛查血清标志物，特异度较好，虽然灵敏度较低，但是相比CEA、CA125对于乳腺癌较低的筛查价值，CA153是血液学筛查乳腺癌最好的单项诊断指标[17-18]。表1、表2数据分别从阳性率及数值差异的角度阐明了CA153在乳腺癌筛查中的意义，我们认为：CA153可作为临床上区分乳腺良恶性病变的筛查指标。表3、表4反映出CA153阳性率及数值跟乳腺癌的分期相关，随着分期的增加阳性率不断上升。与南永刚等[19]研究认为的CA153阳性率及数值可作为乳腺癌的分期预测指标这一研究结论不谋而合。

基于当前乳腺癌对女性影响较大，且尚未找到一种无创高灵敏度的有效筛查方法，本研究采用并联试验以期提高灵敏度和阴性预测值。表1数据反映出联合检测对乳腺癌筛查的意义，表3进一步反映出联合检测在乳腺癌AJCC分期预测中的价值，表5以5个常用的诊断指标整体上反映了联合检测对乳腺癌的诊断效能，其中灵敏度、符合率、阴性预测值均较CTC、CA153单独检测高。说明联合检测较CTC、CA153检测各项诊断性能指标维持在较高水平，整体上提高了乳腺癌的诊断效能，实验结果与设想一致。

尽管国内外有众多学者用不同的血液肿瘤标志物组合报道了联合检测对乳腺癌诊断的效能，本研究结合团队所在的专科特色，以组织病理学诊断结果为金标准，结合最新的细胞染色体形态学CTC检测技术，在国内外首次以传统的肿瘤标志物CA153与最新的染色体形态学CTC检测结果为自变量，以是否为乳腺癌为因变量，拟合CTC与CA153联合检测的Logistic回归模型：Ln(P/1-P)=β0+β1×CTC+β2×CA153(β0为常数项，β1为CTC的回归系数，β2为CA153的回归系数，P为乳腺癌风险概率值)，以预测概率P值(即β0+β1×CTC+β2×CA153)作为两者联合的一个新指标绘制ROC曲线分析，比较了CTC、CA153及联合检测的ROC的AUC。图3证实了联合检测的AUC大于CTC、CA153检测，与表5反映的联合检测比CTC、CA153的整体诊断效能高，前后呼应，结果吻合。因此，基于目前的乳腺癌筛查现状，本研究发现：联合检测较CTC、CA153检测能在整体上提高乳腺癌的诊断效能和诊断价值。该研究结论与2018版中国晚期乳腺癌临床诊疗专家共识[20]倡议的对乳腺癌患者进行CTC和肿瘤标志物检测的观点不谋而合。

由于受到研究时限及标本数量的限制，尽管本文只是初步探讨了CTC、CA153及联合检测在乳腺癌筛查和分期预测中的临床价值。后续研究中，我们将进一步研究CTC和CA153联合检测与乳腺癌患者ER、PR、Ki-67、HER-2等生物标志物及分子分型的相关性，以期能获取更多的乳腺癌生物学信息，进而更好地为乳腺癌患者提供更精准的治疗。