烤烟黑胫病菌发酵液致病活性组分的分离及应用

钟 军，杨 爽，周 田,2， 戴林建*

(1.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2.贵州省六盘水市六枝特区扶贫开发局，贵州 六盘水 553600)

【研究意义】烤烟黑胫病在我国烟区发生较普遍，致使每年的经济损失非常严重[1-3]。因此，开展黑胫病菌致病效果的研究，对现代烤烟产业可持续发展具有重要的意义。【前人研究进展】目前防治烤烟黑胫病最常用的方法是化学防治[4-6]；此外，利用拮抗内生细菌[7-14]、生防菌剂[15]、壳聚糖[16]、植物提取物[17-19]、基因工程[20]等生物防治方法也获得了较好的抗病效果；然而自1972年Carlson[21]第一个分离出耐野火病的烤烟突变体后，利用突变体获得抗病烤烟的研究得到了迅速发展。何云昆等[22]利用叶片悬浮培养筛选出了抗野火病的烤烟新品系；王荔等[23]用黑胫病粗毒素作为选择压，利用烤烟花粉获得6个高抗黑胫病的细胞突变株系；其他研究者也均有通过培养黑胫病病原菌作为选择压来筛选抗突变体的报道[24-25]。在烤烟黑胫病的防治途径中，抗病品种的筛选和培育是最有效的途径，而利用粗毒素或致病活性组分筛选烤烟抗病材料已成为遗传育种的有效补充，越来越受到科研工作者的重视。【本研究的切入点】本论文利用筛选出的黑胫病菌发酵液致病活性组分在细胞水平上(花药)进行烤烟高钾新品系抗黑胫病突变体的筛选，将再生植株进行抗性鉴定。【拟解决的关键问题】以期为早期筛选抗病材料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

烤烟高钾新品系由湖南农业大学戴林建自育的经质子诱变的HKDN-8，田间综合性状表现优良但抗病性差；黑胫病菌(0号生理小种)，由湖南省烤烟公司永州分公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 黑胫病菌发酵液的制备和致病力的检测 将分离提纯的黑胫病菌菌种分别接种于燕麦、V8、马铃薯、烟叶汁和胡萝卜5种固体培养基中(置28 ℃恒温培养箱中暗培养1周)，待其菌丝长满后再分别转入相应的液体培养基中(置于28 ℃、220 r/min的摇床中)；于培养的第5～7 天，收集无菌发酵液后经过4 ℃、8000 r/min离心15 min，将上清液经0.22 μm细菌过滤器过滤除菌后备用[26]；最后，采用离体叶片注射法，取200 mL发酵液接种于离体烟叶上，观察记录烤烟叶片注射区的HR反应，以此检测黑胫病菌发酵液的致病力[27]。

1.2.2 黑胫病菌发酵液活性组分的分离 取发酵液依次通过5 KDa微滤和3 KDa超滤中空纤维素膜，得到超滤液；然后将超滤液经D101型大孔吸附树脂处理后用95 %乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到乙醇洗脱液(发酵液活性组分)。

1.2.3 黑胫病菌发酵液活性组分的应用检测 将消毒的烤烟材料花药接种于MS诱导培养基中，设置6种处理，黑胫病菌发酵液活性组分的浓度分别为：M0处理，0 %；M1处理，1 %；M2处理，2 %；M3处理，3 %；M4处理，4 %；M5处理，5 %，每处理6个培养皿，每个培养皿接种25颗花药，检测花药的萌发情况以确定最适选择压浓度。花培植株抗黑胫病性的检测和鉴定：同1.2.1中的“黑胫病菌发酵液致病力的检测”。以上研究于2015-2016年在湖南农业大学的作物生理与分子生物学教育部重点实验室进行。

2 结果与分析

2.1 黑胫病菌发酵液的培养效果

由图1可知，与培养0 d(对照，CK)相比，黑胫病菌在V8培养基振荡培养5～7 d后获得的发酵液已使叶片注射区出现轻微凹陷状，伴有白色圈点；但总体上烟叶均未出现明显HR坏死斑现象。

图1 黑胫病菌发酵液在V8培养基中的HR反应

由图2可知，在胡萝卜培养基中培养0 d(对照，CK)和5 d，无HR反应；培养6～7 d，白色斑点增多、面积扩大、并伴随着注射区烟叶大范围凹陷；但未产生明显HR坏死斑现象。

图2 黑胫病菌发酵液在胡萝卜培养基中的HR反应

由图3可知，在燕麦培养基中培养0 d(CK)的，烟叶无HR反应；培养5 d，伴有白色斑点出现；培养6 d，白色斑点较大；培养7 d，烟叶注射区产生黄色斑点，虽然有HR反应但不显著。

图3 黑胫病菌发酵液在燕麦培养基中的HR反应

由图4可知，在烟叶汁培养基中培养0 d(CK)的，烟叶未产生HR反应；培养5～7 d，使烟叶注射区出现白色凹陷，伴有白色斑块，部分斑块存在变黄的现象，但也未出现明显HR坏死斑。

图4 黑胫病菌发酵液在烟叶汁培养基中的HR反应

由图5可知，在马铃薯培养基中培养0 d，烟叶无明显损伤；培养5 d，烟叶有轻微坏死斑并伴随着小范围黄色斑点出现；培养7 d，烟叶出现明显抗敏感性坏死斑，即产生HR反应。

图5 黑胫病菌发酵液在马铃薯培养基中的HR反应

由表1可知，马铃薯培养基是诱导黑胫病菌发酵液致病效果最佳的培养基，同时黑胫病菌发酵液需要培养7 d以上，其致病效果才能明显表现出来。

表1 黑胫病菌发酵液在5种培养基中的HR反应

2.2 黑胫病菌发酵液活性组分的致病性

由图6～7表明，与黑胫病菌发酵液原液(C1)的HR反应相比，黑胫病菌发酵液超滤液(C2)可使烟叶病斑面积平均值达0.87 cm2，HR坏死斑反应明显，二者间差异达到1 %的显著水平；与C1和C2的HR反应相比，乙醇洗脱液(C3)使烟叶的病斑面积平均值达0.93 cm2，HR反应的坏死斑更明显，与C1之间呈1 %的差异，而与C2之间呈5 %的差异；这说明C3的致病性最强。

图6 黑胫病菌发酵液不同活性组分的烟叶坏死斑面积差异

图7 黑胫病菌发酵液不同活性组分的烟叶HR反应

2.3 黑胫病菌发酵液活性组分的应用

由图8～9可知，乙醇洗脱液浓度为1 %和4 %时，萌发率分别为16.0 %和6.7 %，与2 %～3 %(10.7 %、9.3 %)处理间的差异呈极显著；说明2 %～3 %为筛选HKDN-8抗黑胫病突变体的最适选择压。

图8 不同选择压浓度下烤烟花药抗黑胫病突变体的萌发率

图9 烤烟花药抗黑胫病突变体最适选择压的筛选

图10～11表明，经过2 %～3 %黑胫病菌发酵液活性组分筛选出的成活花药进行离体培养后的再生植株，其烤烟植株对黑胫病性的抗性分别达到了高抗(HR)和中抗(MR)；而经过4 %黑胫病菌原液筛选出的，对黑胫病性的抗性为高感(HS)，说明本试验中乙醇洗脱液(黑胫病菌发酵液活性组分)对筛选烤烟抗黑胫病突变体是有效可行的。

H.R表示高抗；M.R表示中抗

H.S表示高感

3 讨论与结论

马铃薯培养基是培养烤烟黑胫病菌的最佳培养基，与前人的“燕麦培养基是较适于烤烟黑胫病菌生长的培养基”结果[28]不一致，这可能与培养基性质不同有关，具体原因还有待于从培养基成分对病菌致病力的影响方面进行进一步的分析。

虽然黑胫病菌原液与超滤液均可使烟叶产生HR坏死斑，但乙醇洗脱液使烟叶产生的HR反应更为明显，这说明黑胫病菌致病因子主要存留在乙醇洗脱液中，可用做抗病突变体筛选的致病因子，但还未见有关于烤烟黑胫病菌致病活性组分分离和致病能力的报道。

如果培养基中乙醇洗脱液(黑胫病菌发酵液活性组分)的浓度过低，虽然花药的成活率较高，但不能起到抗病选择压的作用；浓度过高，则导致花药坏死；因此，致病因子最适选择压的确立是筛选抗病突变体植株的关键。本文的结果表明分别利用研究已确定的最适选择压(2 %～3 %乙醇洗脱液和4 %原液)筛选出的花药培养再生植株，前者处理的植株对黑胫病性的抗性分别达到了高抗(HR)和中抗(MR)而后者处理的发病率较高(HS)，说明黑胫病菌发酵液乙醇洗脱液(致病活性组分)对筛选烤烟抗黑胫病突变体是有效可行的，可以作为烤烟早期黑胫病抗性鉴定的手段。