向 娅,柴志欣,武志娟,王吉坤,钟金城
(1.青藏高原生态畜牧业协同创新中心,成都 610041;2.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省教育部重点实验室,成都 610041)
牦牛(Bos grunniens)是分布于青藏高原高寒草地的主要畜种资源,为当地农牧民提供赖以生存的生产生活资料,为重要经济畜种[1]。牦牛生产性能低于其他牛种。近年来,为提高牦牛生产性能,利用牦牛与普通牛种间杂交改良,以提高杂种F1代犏牛产肉和产奶量,犏牛对海拔3 000 m以上高寒草地气候环境有良好适应性,表现杂交优势[2-3]。因种间遗传隔离的影响,母犏牛生殖能力正常,公犏牛因生精机能紊乱而不育,限制犏牛杂种优势和牦牛遗传资源利用。研究显示,犏牛雄性不育主要特征为精子发生受阻,即雄性犏牛性腺发育不良或减数分裂及精子发生存在障碍[4],而减数分裂中多样性异常主要由两牛种遗传基础或遗传结构差异造成。
PRDM9是已鉴定的有助于分离两个脊椎动物物种繁殖障碍的基因[5],该基因编码的蛋白质是具有组蛋白甲基转移酶活性的锌指蛋白,可在减数分裂前期催化组蛋白-H3-赖氨酸4-三甲基转移酶(H3K4me3)。该蛋白质包含多个结构域,如SET(PR/SET)域的子类、一个串联C2H2锌指等。锌指(Zinc finger,ZF)基因家族编码具有锌指模序的转录因子,可有效调控与生长发育相关基因表达。研究表明,MEISETZ(Meiosis-induced factor containing a PR/SET domain and zinc-finger motif)为调控早期减数分裂基因表达候选基因,可编码减数分裂特有H3K4me3,为小鼠同源染色体之间减数分裂重组所必需,在小鼠生殖细胞谱系减数分裂前期正常进程中发挥重要作用[6]。研究发现,具有突变型MEISETZ基因的雄性小鼠睾丸较小,睾丸中无圆形精子、细长精子或精子[7]。MEISETZ编码的氨基酸序列,在N端部分具有PR结构域,C端部分具有C2H2型锌指基序[7],其氨基酸序列与人类PRDM9有较高同源性(72%),尤其是在PR结构域(93%)。组蛋白调控基因表达和染色体结构后天修饰说明MEISETZ是一种减数分裂诱导的组蛋白甲基转移酶,在减数分裂早期特异性表达,且仅在精子细胞进入雌性胚胎生殖腺的减数分裂早期和新生儿睾丸组织中检测到MEISETZ基因转录物产物[6]。对大鼠MEISETZ减数分裂细胞分析显示,因严重损害断裂DNA双链修复途径、同源染色体配对及性小体形成,阻碍减数分裂进程,导致两性不育[6]。
犏牛作为牦牛和普通牛杂交后代,其雄性不育原因可能与MEISETZ基因序列差异具有一定相关性,目前尚未见牦牛、犏牛MEISETZ基因相关报道。因此选取MEISETZ作为目的基因,利用RT-PCR技术对牦牛、犏牛MEISETZ编码区克隆,预测分析核酸序列和蛋白结构,旨在从分子水平探索MEISETZ基因相关特性,为开展犏牛雄性不育相关研究提供理论依据。
样品采集于青海省大通种牛场,选取雄性犏牛(1岁1头,2岁3头,3岁2头)共6头,在四川省九龙县选取成年公牦牛3头(7岁),去势手术后迅速采集睾丸组织,DEPC水冲洗后,于液氮中保存备用。
GoldViewTM核酸染料;TRIzol购自Invitrogen公司;RNA反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time))、pGEM-T Vector cloning kit、DH5α感受态细胞均购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自AxyGENE公司;2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker 2000购自Tiangen公司。
TRIzol法提取牦牛、犏牛睾丸组织总RNA,采用NanoDrop 2000分光光度计测定其浓度及OD260nm/OD280nm值,A260/A280在1.8~2.0时方可采用;配制1.5%琼脂糖凝胶,加入适量GoldViewTM核酸染料,120 V,15 min后,凝胶成像系统检测RNA样品质量。以提取总RNA样品为模板,按照反转录试剂盒说明书合成cDNA,-20℃保存备用。
根据GenBank上已发表MEISETZ基因(Gen-Bank accession NO.:XM_589388)核苷酸序列,利用Primer 5.0软件设计PCR扩增引物:5'AACCGCTCAGCCCTCACTCT 3'(正向),5'TCCTTGACCTCACGACCCTC 3'(反向)。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
PCR反应体系(25 μL):上下游引物各1 μL,cDNA 模板 1 μL,2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。反应程序:94 ℃预变性 5 min;94℃变性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸35 s,33个循环;72℃再延伸7 min;4℃保存。凝胶电泳检测并纯化回收PCR产物,4℃存放。
按照pGEM-T载体试剂盒说明书连接,转化至DH5α感受态细胞中,复苏后,均匀涂布在含Amp+LB固体培养基表面,37℃倒置培养10~12 h;挑取白色单克隆菌落,筛选阳性菌液,送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
根据质粒提取试剂盒说明书提取质粒,将提取质粒加入配制的PCR反应液中,作PCR鉴定,反应体系和程序分别与RT-PCR中反应体系、程序相同。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
将已提取的质粒DNA用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,酶切体系为:去离子水7 μL,质粒DNA 5 μL,HindⅢ 1 μL,EcoRⅠ1 μL,1×M Buffer 4 μL,37℃水浴1 h。酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
分析牦牛、犏牛MEISETZ基因CDS区序列,预测蛋白结构及功能(见表1)。
表1 蛋白质序列数据分析工具Table 1 Protein sequence data analysis tools
采用分光光度法测定本试验中获得的RNA样品,OD260/OD280≈2.0;经1.5%琼脂糖电泳检测发现,存在5 S、18 S和28 S条带且条带清晰(见图1A),说明RNA质量较高,满足后续试验要求。
为得到MEISETZ基因CDS区,以牦牛、犏牛睾丸组织cDNA为模板PCR扩增,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,获得与预期片段长度一致单一清晰条带,长度均为688 bp(见图1B)。参照DNA纯化回收试剂盒说明书回收PCR产物,送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
挑取白色单一菌落,置于含Amp+LB液体培养基中,37℃摇床培养4~6 h,提取质粒后PCR扩增,经1.0%琼脂糖电泳检测。结果显示,所提取质粒成功扩增目的条带(见图2A)。初步证明目的基因片段已重组到pGEM-T载体上。
将提取的重组质粒pGEM-T Vector-MEISETZ用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ酶切消化,消化产物电泳结果如图2B所示,得到2 692 bp载体序列和目的片段,说明目的片段正向插入pGEM-T载体,成功构建重组质粒。
经克隆测序获得牦牛(GenBank accession No.:EF432551)、犏牛(GenBank accession NO.:EF432552)MEISETZ基因CDS区序列长度均为668 bp,编码222个氨基酸残基。将牦牛、犏牛与GenBank中人(GenBank accession No.:DQ388610)、小鼠 (Gen-Bank accession No.:BC023014)相应基因核苷酸序列比对(见图3),结果表明,牦牛与犏牛序列相比,共有4处发生碱基变异,分别位于第270、431、611、648位点,一致性为99.4%;牦牛与人序列相比,共有121处发生碱基变异,一致性为81.9%;牦牛与小鼠序列相比,共有161处发生碱基变异,一致性为74.8%。
利用Mega 7.0软件分析牦牛、犏牛、水牛、人类、小鼠MEISETZ基因氨基酸序列(见图4)。结果表明,犏牛与牦牛聚为一类,亲缘关系最近,其次是人类和小鼠,与水牛亲缘关系最远。
2.5.1 蛋白质理化性质分析
使用软件ExPASy-ProtParam预测牦牛、犏牛MEISETZ蛋白理化性质。牦牛和犏牛MEISETZ基因分子质量分别为25.081和25.098 ku;蛋白等电点均为5.66,为偏酸性蛋白;带负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)均为30个,正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)均为24个,其中丝氨酸(Ser)数量最多,均为23个,占比10.4%,甲硫氨酸(Met)含量最少,均为1个,且除丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)含量有差别外,其余氨基酸含量均相同;不稳定指数分别为48.21、47.68,高于阈值40,表明牦牛和犏牛MEISETZ蛋白结构不稳定;脂肪系数分别为65.9、65.45,说明牦牛、犏牛该蛋白流动性好;总平均亲水系数(GRAVY)为-0.829、-0.848,结合ExPASy-ProtScale预测结果,牦牛、犏牛MEISETZ蛋白中大多数氨基酸为亲水性,属于亲水性蛋白。
2.5.2 二级结构及三级结构预测
利用在线软件ExPASy-SOPMA预测牦牛、犏牛MEISETZ蛋白二级结构(见图5)。
牦牛、犏牛该蛋白均含有α-螺旋(Hh)、无规则卷曲(Cc)、β-转角(Tt)和延伸链(Ee),其中牦牛、犏牛无规则卷曲含量均最高,共135、124处,分别占二级结构的60.81%、55.86%,β-转角含量均最低,仅4.5%。
采用ExPASy-SWISSMODEL在线软件,选取与氨基酸序列相似性最高序列,基于PDB数据库预测其三级结构模型(见图6)。
结果显示,牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均与4c1q.1模型相似性高达84.96%,三级结构均以无规则卷曲为主,与二级结构预测结果相符。
2.5.3 保守结构域预测
利用NCBI-CD Search预测牦牛、犏牛MEISETZ蛋白氨基酸序列保守结构域(见图7)。结果显示,牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均含有SET超家族结构域,Trithorax(SET)结构域超家族对应于含有SET结构域的赖氨酸甲基转移酶,对真核生物中基因激活和沉默的表观遗传调控至关重要。已证明SET域介导与双特异性磷酸酶(dsPTPases)相似的蛋白质家族相互作用。该蛋白与PR域锌指蛋白7(PRDM7)和9(PRDM9)发现的PR-SET域高度重合。
2.5.4 跨膜结构及信号肽预测
ExPASy-TMHMM预测表明牦牛、犏牛该蛋白氨基酸均位于细胞膜表面,无跨膜结构域。使用ExPASy-TMPred在线软件分析发现,牦牛和犏牛MEISETZ蛋白包含2个较高可能的跨膜螺旋,无跨膜蛋白。牦牛、犏牛MEISETZ蛋白信号肽位点预测结果显示,MEISETZ蛋白无信号肽,均为非分泌型蛋白。
2.5.5 磷酸化位点及糖基化位点预测
在线软件NetPhos预测显示,牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均包含31个潜在磷酸化位点,其中Ser磷酸化位点均为20个,4个Thr磷酸化位点(第6、46、61、180位),7个Tyr磷酸化位(第56、67、69、83、126、189、206位)。
分别利用在线软件ExPASy中NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0预测O、N糖基化位点。分析结果表明,牦牛MEISETZ蛋白含有14个O-糖基化位点,犏牛MEISETZ蛋白存在12个O-糖基化位点;牦牛、犏牛均在第1位检测到1个潜在N-糖基化位点,由于无信号肽的蛋白质不可能暴露于N-糖基化机制,即使该蛋白包含潜在的糖基化位点,也不可能在体内被糖基化。
2.5.6 亚细胞定位
利用PSORTⅡPrediction在线软件预测牦牛、犏牛MEISETZ蛋白功能,结果显示,MEISETZ蛋白主要定位于细胞核(73.9%)中,在细胞质、细胞外(包括细胞壁)中均占8.7%,4.3%分布于线粒体和过氧化物酶。
2.5.7 蛋白互作分析
STRING分析发现,PRDM9与SPO11蛋白相关性高达0.976,与组蛋白家族中核小体组蛋白H2A、H2B相关性均高于0.9(见图8)。SPO11是减数分裂重组所需的拓扑异构酶6复合物成分,与TOP6BL共同介导DNA裂解,形成双链断裂(DSB),启动减数分裂重组;该复合物通过切割和连接循环促进负、正超螺旋DNA松弛以及DNA脱级。
犏牛雄性不育主要是由精子发生过程中减数分裂缺陷导致,导致减数分裂缺陷的机制仍未知。多项研究发现,MEISETZ可调控生殖细胞特异性基因表达,影响细胞减数分裂[8-9]。犏牛由牦牛与黄牛杂交而来,公牛表现为不育,F1代犏牛在屠宰率、胴体体重、肉、乳生产能力等方面均优于牦牛[10],但犏牛不育问题迄今尚未解决。本研究对牦牛、犏牛MEISETZ基因开展克隆和生物信息学分析,初步探索MEISETZ与犏牛减数分裂阻滞引起的无精症之间的可能联系。
本研究使用DNAMAN软件比对牦牛、犏牛MEISETZ基因核苷酸序列,结果表明,牦牛与犏牛相比,第270(C-T)和648(T-C)位点发生碱基转换,431(C-G)和611(C-A)位点处发生碱基颠换,同源性为99.4%。Miyamoto等研究发现,因减数分裂阻滞而导致无精子症的日本男性患者精子发生受阻可能与外显子6的614位核苷酸的等位基因C和外显子9的1086位核苷酸的等位基因T有关[11]。因此,犏牛雄性不育可能与611、648位点突变有关,但其具体调控机制还需进一步验证。牦牛MEISETZ蛋白222个氨基酸序列与犏牛相比,仅2个位点发生变异,144位(A-G)由丙氨酸变为甘氨酸、204位(P-Q)由脯氨酸变为谷氨酰胺,氨基酸序列同源性为99.1%。王薇薇研究发现,日粮中添加甘氨酸(Gly)提高新生和断奶仔猪生长性能[12];谷氨酰胺(Gln)具有增加力量、提高耐力作用。犏牛体型增大、役力更强、产奶、产肉性能的提高可能与第144、204位氨基酸突变存在关联。系统进化树结果显示,犏牛先与牦牛聚为一类,亲缘关系最密切,表明牦牛与犏牛序列高度保守。牦牛与普通牛分属于不同牛种,在基因DNA序列保持不变基础上,基因功能在遗传信息从DNA传递给RNA和蛋白质的过程中可能发生变化,导致犏牛雄性不育。
本研究通过牦牛、犏牛MEISETZ蛋白理化性质分析发现,丝氨酸(10.4%)、脯氨酸(8.1%、7.7%)、谷氨酸(7.7%)、亮氨酸(9.0%)含量较高。丝氨酸在脂肪和脂肪酸新陈代谢及肌肉生长中发挥重要作用[13],研究发现在小鼠阴茎海绵体[14]、食管下括约肌[15]均发现D-Ser发挥重要功能。亮氨酸可作为营养增补剂、调味增香剂,谷氨酸增强食品风味,且对动物性食品有保鲜作用,故而牦牛、犏牛肉质细嫩,味道鲜美。精氨酸(6.8%)具有促进精子生成和提高精子活力功能[16],且在一定程度上改善家畜胴体组成及肉质性状指标。本研究显示,牦牛、犏牛MEISETZ蛋白理化性质相似,推测犏牛雄性不育可能与蛋白质结构无关。
亚细胞定位表明牦牛、犏牛该蛋白主要定位于细胞核中,该蛋白对于核定位至关重要。保守结构域预测显示,牦牛、犏牛MEISETZ蛋白均含有SET超家族结构域,Trithorax(SET)结构域超家族对应于含有SET结构域的赖氨酸甲基转移酶,对于真核生物中基因激活和沉默的表观遗传调控至关重要。研究发现,MEISETZ具有催化三甲基活性,但对组蛋白-H3-赖氨酸4的单甲基和双甲基无催化作用,且转录活性依赖其甲基化活性[6];在缺乏MEISETZ基因睾丸中,组蛋白-H3-赖氨酸4的三甲基减少,减数分裂基因转录被改变[7]。利用GAL4系统作反式激活分析表明,MEISETZ也可依赖其HMTase活性方式激活转录[6];MEISETZ可与转录活性相关蛋白质(与RNAPolII相关的SET1)形成复合物[17-18]。该蛋白与PR域锌指蛋白9(PRDM9)发现的PR-SET域高度重合。通过蛋白互作分析发现,PRDM9蛋白与 HIST1H2BA、HIST2H2BE、HIST2H2AC等核小体组蛋白相关性均较高。HIST1H2BA(0.924)是一种H2B类型的变异组蛋白,此蛋白在雄性生殖细胞中直接指导解离核小体转化为鱼精蛋白,完全取代经典组蛋白H2B之前的核小体向鱼精蛋白过渡,且可能充当核小体解离因子,促进组蛋白大规模交换。HIST2H2BE、HIST2H2AC、HIST1H2BN、HIST1H2BB和H2BFS均是核小体核心成分,在转录调控、DNA修复、DNA复制和染色体稳定中发挥主要作用。
睾丸、脑RNA结合蛋白(Testis brain RNA-binding protein,TB-RBP)在睾丸和脑组织中可与靶基因mRNA特异性结合,主要参与减数分裂后部分靶基因转录后调节,调控精子变态成形相关基因,是精子发生过程转录因子之一。柴志欣等通过牦牛、犏牛TB-RBP基因克隆及组织表达分析发现,TB-RBP蛋白属于Translin结合蛋白家族,对精子发生等生物过程具有重要调控作用;TBRBP基因在牦牛中表达水平显著高于犏牛(0.01<P<0.05)[19],TB-RBP基因是精子正常发育的关键基因,在犏牛睾丸组织中表达量较低,表明犏牛雄性不育与精子发生异常有关。
多项研究表明哺乳动物Y染色体部分快速退化可能是缺乏基因间重组,雄性基因变异和积累增加,使X染色体或常染色体与Y染色体形成遗传互作[20-22]。TSPY相关序列和其他Y染色体高度重复序列、快速协同进化和减数分裂期的基因重排的缺乏证实MSY进化(易位,扩增,删除和基因转变)具有水平效应。
TSPY抗原决定簇主要定位于精原细胞亚型的细胞质和成人睾丸曲细精管基膜[23],且TSPY的精原细胞与邻近低表达细胞成对存在。因精子发生受雄激素影响[24-25],若TSPY在介导精原干细胞进入减数分裂期时具有重要作用,则其表达很可能受雄激素和雄激素受体调控;且由于一个或几个其转录单元调控元件突变,或睾丸中激素环境变化产生机体中不适应信号,使TSPY不表达。张利亚等推测牦牛和犏牛TSPY蛋白参与雄性减数分裂过程中精原细胞、初级精母细胞调控[26]。官久强等通过黄牛、犏牛和牦牛睾丸组织TSPY基因荧光定量分析表明,TSPY基因拷贝数与犏牛雄性不育可能存在一定联系[27]。
推测雄性犏牛不育可能与以下两方面遗传机制有关:大多数雄性犏牛减数分裂过程处于异常状态,为两个牛种染色体基因性质或位置差异所致[4]。但两个亲本牛种的染色体自发畸变频率较高,如果具有不同遗传背景的染色体畸变携带者杂交,产生的杂种个体在减数分裂时可能造成染色体无法配对联会,染色体之间发生同源片段或异源片段联会等复杂情况,使减数分裂过程错乱。
核质互作关系也是导致雄性不育的可能因素。犏牛体细胞的细胞质为母源,细胞核中一套染色体源于母体,另一套染色体源于父体。对于雄性犏牛,来自父本的Y染色体和一套常染色体,由于物种差异与母本的X染色体和另一套常染色体之间不协调,且与来自母体的细胞质不亲和,影响雄性生殖功能有关基因表达,出现生殖障碍问题。
本研究克隆牦牛、犏牛MEISETZ基因CDS区序列,比对其核苷酸、氨基酸序列,发现2个位点氨基酸突变,推测其可能与犏牛雄性不育有关,可为牦牛、犏牛MEISETZ基因结构与功能研究提供基础数据,为进一步研究犏牛雄性不育提供理论依据。