苦碟子总黄酮提取纯化工艺研究

刘 芳 武 勇 周应军 谭卫忠

1.长治医学院，山西长治 046000；2.山东福牌阿胶股份有限公司，山东济南 250100；3.中南大学湘雅药学院，湖南长沙 410083；4.国药控股济南有限公司，山东济南 250116

苦碟子为菊科植物抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia（ Bge.） Hance 的干燥全草[1]，在中国、朝鲜、日本、俄罗斯等国均有分布，我国主要分布于东北及内蒙古等地，收录于《全国中草药汇编》。苦碟子味苦、辛、性寒，能止痛、清热、解毒、消肿，主治头痛，牙痛，胃肠痛及外伤、中小手术后头痛[2]。在民间常被用作野菜、饲料，近年来随着研究的深入，发现主要含有黄酮类、倍半萜内酯类、三萜类、核苷类、有机酸类等化合物[2]，其中黄酮类化合物含量较高，主要有木犀草素、芹菜素及其苷类[3-7]。现代药理研究表明，苦碟子黄酮类成分能通过增强机体对自由基的清除能力，减少脂质过氧化反应，解除冠脉痉挛，减少血小板聚集，减轻心肌梗死，缺血心肌FFA含量，从而对心肌缺血/再灌注损伤产生保护作用[8-10]。苦碟子总黄酮通过拮抗细胞内钙超载，减少自由基的产生，抑制NO生成，产生对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用[11-12]。因此缩短提取纯化工艺，提高总黄酮的提取率，具有非常重要的意义。

本实验采用适合于工业生产成本低、便于操作的水提醇沉法对苦碟子总黄酮的水提醇沉工艺进行了优化，并采用聚酰胺树脂纯化总黄酮粗提物，通过不同条件下聚酰胺树脂对苦碟子总黄酮动态吸附与解吸特性的研究，确定最佳纯化工艺。本工艺具有操作简单、方便、安全，成本低、效率高的特点，为苦碟子总黄酮工业化生产提供实验依据。

1 仪器与试剂

TU-1810 型紫外-可见分光光度计（ 北京普析通用有限公司），AUW220D 十万分之一电子分析天平（日本岛津公司），KQ 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率250W，频率40kHz），FD-A10N-50型冷冻干燥机[冠森生物科技（上海）有限公司]。

苦碟子药材采自黑龙江哈尔滨，由作者鉴定为菊科植物抱茎苦荬菜I.sonchifolia（ Bge.） Hance的干燥全草，芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号111528-200606）。聚酰胺（60～80目，青岛海洋化工厂）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 苦碟子总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取105℃的干燥至恒重的芦丁对照品20.4mg，精密称定，置25mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，摇匀，浓度为0.8160mg/mL，作为对照品储备液。

2.1.2 标准曲线的测定 精密吸取芦丁对照品储备液 1、2、3、4、5mL 分别置于 25mL 容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，浓度分别为0.03264、0.06528、0.09792、0.13056、0.1632mg/mL。分别取 5mL 置于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠0.3mL，摇匀，放置6min。再加入10%硝酸铝0.3mL，摇匀，放置6min后，加入1mol/L的氢氧化钠4mL，用60%乙醇稀释至10mL，摇匀，静置10min。同时取各对照品溶液5mL，加60%乙醇稀释至10mL，静置10min，作为空白。采用分光光度法，在波长505nm处测定吸光度。以吸光度（A）值对浓度（C）进行线性回归，得回归方程A=6.4430C+0.0001，r=0.9999，线性范围为32.64～163.2μg/mL。

2.1.3 样品测定 精密吸取供试品溶液，按2.1.2项下方法测定各供试品溶液的吸光度值，测定3次，取其平均值，根据回归方程计算供试品溶液中苦碟子总黄酮的含量。

2.2 苦碟子总黄酮的提取工艺

2.2.1 正交试验因素与水平设计 根据预试验，选择影响苦碟子总黄酮提取的加水量、提取时间、溶液pH值、醇沉体积4个因素，以提取液中苦碟子总黄酮的含量为指标，采用L9（34） 正交表进行实验设计（见表1），优选最佳工艺参数。

表1 正交试验因素水平表

2.2.2 提取工艺考察 取干燥苦碟子药材粉末（过40目筛）约50g，置圆底烧瓶中，按表2正交试验设计的加水量、提取时间，加热回流提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩至相当于含生药1g/mL的溶液。加盐酸调节pH值至规定值，加规定体积的90%乙醇充分搅拌后，冰箱静置过夜，离心（2500r/min，5min），取上清液减压浓缩至无醇味，加水稀释至相当于含生药1g/mL的溶液，测得其总黄酮含量。

2.2.3 正交试验结果 各因素的影响程度依次为的主次因素为A＞D＞B＞C，即加水量＞醇沉体积＞提取时间＞溶液pH值。本试验结果分析得出最佳条件为A2B2C2D2，加10倍量水，加热回流提取两次，分别为1h、0.5h，过滤，合并，浓缩后加盐酸调节pH值至2，加入4倍量90%的乙醇进行沉淀。方差分析可知，四因素均无显著性影响。见表2。

2.2.4 苦碟子总黄酮提取工艺验证试验 根据优选得到的最佳工艺条件提取苦碟子总黄酮3批，减压浓缩至小体积后冷冻干燥，称定冻干粉重，计算冻干粉中总黄酮的含量，并计算转移率，见表3，冻干粉中总黄酮平均含量为15.28%，平均转移率为75.85%，表明该提取醇沉工艺稳定、可行、重现性好。

2.3 聚酰胺树脂纯化苦碟子总黄酮的工艺研究

2.3.1 聚酰胺的预处理 取聚酰胺树脂，过60目筛。将树脂用蒸馏水充分淋洗，沥干，用95%乙醇浸泡24h，湿法装柱；依次用50%，20%乙醇淋洗，洗至不呈白色浑浊为止，再以蒸馏水洗至无醇味，倒出，置于烘箱中90℃烘干，备用。

表2 正交试验结果

表3 验证试验结果

表4 树脂粒度考察结果

2.3.2 树脂粒度的考察 取已处理好的30～60目、60～80目、80～100目的聚酰胺树脂约5g，湿法装入内径为1.0cm的色谱柱中（柱体积约33mL），以2mL/min的流速，加入60mL苦碟子提取液（相当于含生药0.5mg/mL的溶液），收集流出液。精密吸取流出液3mL加水稀释至25mL，按2.1项下方法测定流出液中总黄酮的含量，计算吸附量与吸附率。静置吸附2h后，蒸馏水洗脱60mL，弃去；再0.03%氨水洗脱90mL，收集洗脱液，精密吸取1mL放入50mL容量瓶中加0.03%氨水稀释至刻度，按2.3项下方法测定其吸光度值，计算解吸量与解吸率。见表4。

注：Qa吸附量（mg/g），Ra吸附率（%），Qd解吸量（mg/g），Rd解吸率（%），C0上样溶液质量浓度（mg/mL），Cr流出液质量浓度（mg/mL），V上样溶液体积（mL），W干树脂质量（g），Cd解吸液浓度（mg/mL），Vd解吸液体积（mL）

结果显示，随着聚酰胺粒径的增大，总黄酮的吸附量及吸附率均呈上升趋势，但80～100目聚酰胺的解吸量与解吸率由于形成死吸附而降低，因此选择动态吸附及解吸率均较最高的60～80目聚酰胺进行纯化。

2.3.3 上样溶液浓度的考察 按2.3.2项下具体操作，以2mL/min的流速，分别加入总黄酮含量为8.59、5.73、2.29、1.14mg/mL 苦 碟 子 提 取 溶 液（相当于将含生药1g/mL的溶液分别稀释至含生药0.75、0.5、0.2、0.1g/mL 的提取溶液）。收集馏分，每10mL为一管，测定总黄酮含量，计算泄漏率。泄漏率达10%停止上样，计算吸附量与吸附率。静置吸附2h后，蒸馏水洗脱60mL，弃去；再0.03%氨水洗脱90mL，收集洗脱液，计算解吸量与解吸率。见表5。

注：Rl解吸率（%），C0上样溶液质量浓度（mg/mL），Cr流出液质量浓度（mg/mL）

表5 上溶液浓度考察结果

由结果可见，当泄漏率约为10%时，随上样溶液浓度的增加，吸附量增加，并且达饱和时间缩短，但是当上样溶液达到一定浓度时，由于溶液粘稠，在柱顶形成死吸附而不能解吸，使得解析率反而下降。因此选择含生药5.73mg/mL为最佳上样溶液浓度（相当于含生药0.5g/mL）的溶液，上样体积为70mL（约相当于2BV）。

2.3.4 上样流速的考察 按2.3.2项下具体操作，分别以1、2、3mL/min的流速上样，加入苦碟子提取液（相当于含生药0.5g/mL）。收集流分，每10mL为一管，测定总黄酮含量，计算泄漏率。当泄漏率达10%时停止上样，计算吸附量与吸附率。由表6可见，流速在1～3mL/min时，树脂的吸附量随体流速的增大而下降，流速过大，吸附量下降，提早泄漏；流速过小，树脂的吸附量大，但是达饱和时间延长，工作效率降低。同时兼顾工作效率和吸附效果，选择2mL/min为最佳流速，上样体积70mL（约相当于2BV）时达饱和。

表6 上样流考察结果

2.3.5 冲洗杂质溶剂用量的考察 按2.3.2项下具体操作，以2mL/min的流速加入70mL苦碟子提取液（相当于含生药0.5g/mL）。饱和吸附后，静置2h，用蒸馏水进行洗脱，收集洗脱液。每10mL为一管，测定洗脱液中总黄酮含量。结果显示，总黄酮在40mL水洗脱时产生了流失，之后树脂对黄酮进行了很好的富集，不再洗脱下来。水洗后总黄酮的损失率为3.24%，经过60mL水洗脱后无色，可有效的去除极性较大的杂质，提高总黄酮纯度。见表7。

表7 冲洗杂质溶剂用量考察结果

2.3.6 洗脱溶剂的考察 按2.3.2项下具体操作，以2 mL/min的流速加入70mL苦碟子提取液（相当于含生药0.5g/mL）。饱和吸附后，静置2h，先用蒸馏水洗脱60mL，弃去；再分别以30%、50%、70%乙醇水溶液、0.03%氨水各90mL洗脱，收集洗脱液，计算解吸量与解吸率。见表8。

表8 洗脱溶剂考察结果

黄酮类化合物解吸常用的洗脱剂有不同浓度乙醇和碱液，试验结果表明在相同的洗脱体积下，随着醇浓度的增加，解吸率在增高，但0.03%氨水的洗脱能力最强，解吸率最高。因此选择0.03%氨水溶液为洗脱剂。

2.3.7 洗脱溶剂体积的考察 按2.3.2项下具体操作，以0.03%氨水为洗脱溶剂，收集馏分，测定总黄酮含量，计算解吸量与解吸率。由表9结果可知，随着洗脱溶剂体积的增加，苦碟子总黄酮的解吸率也随之增加，但洗脱溶剂用量超过90mL后，解吸率增加趋于平缓，因此选择90mL（约相当于3BV）为洗脱溶剂体积。

表9 洗脱溶剂体积考察结果

2.3.8 验证试验 按2.3.2项下具体操作，以2mL/min的流速加入70mL苦碟子提取液（相当于含生药0.5g/mL）。饱和吸附后，静置2h，先用蒸馏水洗脱60mL，弃去；再分别0.03%氨水各90mL洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，计算解吸量与解吸率。洗脱液减压浓缩至小体积后冷冻干燥，称定，计算总固体物中总黄酮的含量。

由表10结果可知，通过聚酰胺分离纯化，冻干粉中苦碟子总黄酮含量可达51.98 %，比提取醇沉后总黄酮含量15.28%，提高了2.4倍，说明采用聚酰胺树脂可以富集纯化苦碟子提取物中的总黄酮，转移率为64.15%。

表10 验证试验结果

2.4 工艺放大

取已处理好的60~80目的聚酰胺树脂约50g，湿法装入内径为7.0cm的色谱柱中（柱体积约360mL），以2mL/min的流速加入苦碟子提取液（相当于含生药0.5g/mL）2BV。饱和吸附后，静置2h，先用2BV蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；再以0.03%氨水洗脱3BV，收集洗脱液。减压浓缩至小体积后冷冻干燥，称定，计算总固体物中总黄酮的含量。见表11。

表11 工艺放大结果

3 讨论

苦碟子中主要含有木犀草素、芹菜素等黄酮及其苷类化合物，此类化合物在70%乙醇中溶解良好，同时在热水中有较好的溶解性。在预实验中进行了醇提实验，采用70%乙醇，10倍量提取两次，每次1h，合并两次提取液，经测定苦碟子总黄酮含量为1.45%，与水提液无明显差异。又考虑到水提取较为方便，安全，成本较低，且临床方剂及原苦碟子注射液的提取工艺也采用水提取的方法，因此本文采用水作为提取溶媒。

本文采用正交设计法对苦碟子总黄酮的提取工艺进行优化，以提取液中总黄酮含量为指标，通过对影响提取工艺的加水量、提取时间、溶液pH值和醇沉体积等因素进行考察，最终确定最佳的提取工艺条件为：加10倍量水，加热回流提取两次，分别为1h、0.5h，过滤，合并，浓缩后加盐酸调节pH值至2，加入4倍量90%的乙醇进行沉淀，离心（2500r/min，5min），取上清液减压浓缩至无醇味，加蒸馏水稀释至相当于含生药0.5g/mL的溶液（适于聚酰胺纯化上样溶液浓度）。该方法具有能耗小、提取效率高的特点，且经过验证该工艺稳定、可行。

总黄酮的纯化一般采用大孔吸附树脂[13]、聚酰胺树脂[14]以及不同树脂联用[15-16]等吸附解析的方法。聚酰胺树脂是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，它通过氢键和范德华力对黄酮类化合物有较强的吸附性能[17]。本研究对比了不同粒径的聚酰胺树脂苦碟子总黄酮的吸附能力和解吸附能力，优选了60~80目聚酰胺树脂富集苦碟子总黄酮。并采用单因素比较法对上柱溶液浓度及体积、流速、冲洗杂质溶剂用量、洗脱溶剂、洗脱溶剂体积等进行了考察，确定了最佳的纯化工艺：以2mL/min的流速加入含生药0.5g/mL苦碟子提取溶液2BV，饱和吸附后静置2h，先用2BV蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；再以0.03%氨水洗脱3BV，收集洗脱液。经放大工艺，苦碟子提取物经聚酰胺纯化得到的总黄酮含量达50%以上。

本研究建立了工艺简单、稳定、可行的苦碟子总黄酮的提取纯化方法，为苦碟子总黄酮的进一步工业化生产和开发利用提供一定的实验基础。