基于16S rRNA的肝郁血虚型失眠患者口腔微生态与中医舌象的相关性研究

刘 梦，王曦廷，李 峰，谭丽博，李 杰，关 静

（北京中医药大学中医学院，北京，100029）

失眠症是世界范围内的慢性疾病[1-2]。研究表明，失眠证的相关发病机制与中枢神经系统γ-氨基丁酸（GABA）能等神经递质关系密切[3-4]。近年来，有关肠-菌群-脑轴的研究逐渐受到关注[5-7]，它揭示了肠道微生态、药物经肠道代谢及大脑中枢神经系统三者间存在的潜在对话机制[8]。研究表明，菌群与宿主免疫系统、中枢神经系统等调节机制关系较为密切，口腔菌群也与大脑内病变（例如帕金森疾病）具有潜在的关联[9-10]。

中医认为“心主神志”，心主神志的气机功能失调，是失眠的主要原因。肝主气机疏泄，与情绪、心理关系密切。故中医治疗失眠症多从“心与肝”论治。随着社会经济发展，社会关系及工作压力等因素影响，肝郁血虚型失眠患者较为多见。肝郁血虚型失眠患者常表现为入睡困难、睡后不实、易受惊扰，且情绪常伴抑郁倾向，也表现出面苍白、面色淡白或萎黄，唇舌爪甲色淡，头晕眼花，心悸多梦等血虚症状。临床治疗肝郁血虚型失眠患者，往往也将舌象作为辨证论治的重要依据。其中淡白舌者，红色偏少而白色偏多，多提示气血亏虚，血不荣舌，或阳气虚衰，运血无力；紫暗舌者为气血运行不畅的病理改变。

本研究基于课题基金“失眠症常见证候的舌面菌群特征及与舌象相关性的研究”的支持，从肝郁血虚型失眠患者中筛选出具有典型淡白舌舌象与紫暗舌舌象受试者，收集其口腔菌群样本，采用16S rRNA 的技术检测。通过生物信息学分析和统计学分析，探究肝郁血虚型失眠患者中淡白舌与紫暗舌在口腔菌群生物多样性和物种构成上的差异，以期为揭示导致舌象差异的潜在口腔微生态机理提供思路。

1 材料与方法

1.1 病例筛选

1.1.1 失眠症及证型诊断标准

参照由中华医学会精神科分会制定的《中国精神障碍分类与诊断标准CCMD-3》[11]中非器质性失眠症的诊断标准。纳入患者应满足如下失眠特征：①几乎以失眠为唯一的症状，包括难以入睡、睡眠不深、多梦、早醒、或醒后不易再睡、醒后不适感、疲乏，或白天困倦等；②具有失眠和极度关注失眠结果的优势观念；③对睡眠数量、质量的不满引起明显的苦恼或社会功能受损；④至少每周发生3次，并至少已1个月。

中医肝郁血虚型诊断标准参照：①主证：失眠，抑郁易怒，神疲乏力；②次证：面色少华，眩晕耳鸣，胸胁胀痛，食少纳呆，大便结；舌质红，舌苔白或微黄，脉弦细或弦细数。主证必须具备,并兼有次证1 项以上，结合相应舌脉即可诊断。

1.1.2 纳入标准与排除标准

本实验患者招募于北京市国医堂中医门诊部。对受试者设定如下纳入标准，需符合下列中西医诊断标准：①患者匹兹堡睡眠指数（PSQI）总得分≥8分；②受试者年龄范围为18-65 周岁；③实验患者自愿参加本观察且征求患者知情同意。同时，对于所招募患者，如出现如下情况者予以排除：①有口腔疾病或口腔卫生问题；②有慢性胃肠道疾病的患者；③精神障碍或器质性疾病症状所引起的失眠患者；④孕妇及哺乳期妇女；⑤药物或酒精引起的失眠患者；⑥合并有严重全身性疾病者。

1.1.3 病例资料收集

采集受试者口腔菌群时间统一为清晨8 点，所有受试者于采集口腔菌群前20 min 进行纯净水漱口。采集者使用一次性DNA 采集包（粤深械备20160060）进行口腔菌群的收集，使用方法为采集者手持一次性无菌拭子各旋转刮拭脸颊内侧20次，尽量避免接触牙齿和舌头，随后将拭子放入采样管样液中，每位受试者均收集2个样本以备用，随后立即放入-80℃冰箱进行样本冻存。

1.2 PCR实验及质控

首先，对各样本进行基因组DNA 的抽取。针对V3 与V4 测序区域合成带有条码的引物，或者合成带有错位碱基的融合引物。将同一样本的PCR 产物混合，并用2%琼脂糖凝胶电泳检测。通过尽可能使用低循环数扩增，并且保证每个样本扩增的循环数一致的方式保证后续数据分析的准确性及可靠性。最后，采用随机方法选取具有代表性的样本来进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。随后，构建Miseq 文件库，并进行Miseq 上机测序。进行格式规范处理、数据去杂、有效数据统计、优势序列分布。将下机后原始数据结果以FASTQ 格式存储。随后对FASTQ 数据进行过滤处理。过滤read尾部质量值20以下的碱基，其中融合的利用软件Trimmomatic，barcode的利用软件Pear。

1.3 生物信息学与统计学分析

采用Qiime[12]进行OTU 聚类。通过聚类操作可以使序列按照相似性归为许多小单元。设置0.97 相似度阈值对所有序列的OTU 单元进行聚类。选择16 s细菌和古菌核糖体数据库，选择silva128 Silva，采用RDP Classifier 算法，置信度阈值为0.7，得到每个OTU对应的物种分类信息，并在界（kingdom）、门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）、种（species）各个水平注释其群落的物种信息。对所有样本按照分组样本的方式进行生物多样性分析。微生物组学中α多样性主要反映微生物群落的丰度和多样性，一般用Chao1 指数（菌种丰富度指数）、Shannon（值越大，说明群落多样性越高）；β多样性分析可以进行进一步的样本间生物多样性差异性对比。统计分析使用R语言完成。

2 结果

2.1 数据质量分析

图1 生物多样性曲线。

对所有样本进行稀释性曲线（Rarefaction curve)、Shannon-Wiener 曲 线、Rank-Abundance 曲 线、Specaccum 物种累积曲线分析，以对比测序数据量不同的样本里物种丰度和说明测序样本的数据量是否合理。结果如图1-A 所示，随着样本测序量的增加，受试者样本的OTU 数量递增；各样本在深度增加至15 000 后OTU 数增加量趋于平缓，说明测序数据量合理。Shannon-Wiener 分析结果见图1-B，Shannon 指数在经过快速增长后表现趋于平缓，表明样本的测序结果可以反映绝大多数的微生物信息，样本的测序质量有效。Rank-abundance 曲线见图1-C，水平方向宽度较宽，曲线较为平滑，表明本研究中收拾者样本的物种丰度及均匀度较好。物种累积曲线结果见图1-D，受试者样本在持续抽样过程中，曲线区域平缓，表明样本抽样充分，不需增加新样本，可以进行下一步数据统计分析。

2.2 OTU聚类注释分析

为了使OTU 单元聚类结果可靠，本研究将测序深度稳定在15 969 tag，共产生2 195个OTU，其中单样本最小OTU 单元数量值为152，最大OTU 单元数量值为872。随后进行OTU 基础分析，对肝郁血虚型失眠患者中医舌象亚组绘制韦恩图。韦恩图表明，肝郁型失眠患者组（图2-A 中a 圈）独有577 个OTU 单元；血虚型失眠患者组（图2-A 中b 圈）独有468 个OTU 单元，两组共有1150个OTU单元。

为了进一步探究样本中普遍存在哪些OTU，即寻找出核心OTU，本研究通过Qiime 平台对所有样本的OTU 进行了核心微生物（Core microbiome）分析，结果见图2-B。在随着参与样本的扩增，核心物种值随之下降，一直到样本扩增到所有样本（即x 轴坐标为1.0）时，共有OTU 的最终为链球菌、奈瑟菌属、梭杆菌属等17种。

2.3 物种组成及生物多样性分析

进一步分析各组物种组成的成分以及两组样本间物种组成的差异。分别从门水平和属水平比较两组的优势物种分布。结果表明，所有样本主要由15个菌门中的245 个菌属构成，其中10 个优势菌门为：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、TM7、绿弯菌门、蓝细菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、螺旋体门。门水平上，5 种优势菌门相对丰度共96.48%：厚壁菌门（相对丰度：43.13%，下同）、变形菌门（20.60%）、放线菌门（11.07%）、拟杆菌门（13.78%）、梭杆菌门（7.9%）。属水平上，7 种优势菌属相对丰度共68.32%：链球菌（31.14%）、奈瑟菌（10.21%）、罗斯氏菌（7.62%）、梭杆菌（4.06%）嗜血杆菌（3.73%）。

图2 A肝郁型失眠患者组（a）与血虚型失眠患者组（b）OTU韦恩图；B所有样本核心微生物

图3 肝郁型失眠患者组与血虚型失眠患者组口腔微生物菌群构成（门与属水平）

对于淡白舌组，门水平上优势菌群为厚壁菌门（44.28%）、变形菌门（26.93%）、放线菌门（12.62%）、拟杆菌门（8.42%）、梭杆菌门（6.04%），见图3-A；属水平上，优势菌群为链球菌属（32.43%）、奈瑟菌属（14.11%）、罗氏菌属（9.36%）、嗜血杆菌属（5.12%）、普雷沃菌属（4.28%），见图3-B。对于紫暗舌组，门水平上优势菌群为厚壁菌门（41.97%）、拟杆菌门（19.14%）、变形菌门（14.27%）、梭杆菌门（9.80%）、放线菌门（9.51%），见图3-C；属水平上优势菌属为链球菌属（29.87%）、普雷沃菌属（11.13%）、奈瑟菌属（6.32%）、罗氏菌属（5.89%）、梭杆菌属（5.67%），见图3-D。

随后，使用Wilcoxon 检验，对淡白舌组与紫暗舌组进行差异菌群统计分析。门水平上，物种丰度大于1%的差异菌门有：变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门（图4-A、B）。属水平上，物种丰度大于1%的差异菌属有：奈瑟菌属、罗氏菌属、普雷沃菌属、梭杆菌属、卟啉单胞菌属、韦荣球菌属（图4-C、D）。

对两组样本进行α多样性分析，结果见图5。由图可以看出，淡白舌组口腔菌群的α多样性指数略大于紫暗舌组，差异具有显著性。进一步进行β生物多样性分析。PCA 降维表明，紫暗舌组样本可形成聚落，而淡白舌组样本相对分散，两组样本的分布可以找到较为明显的区分线。

图4 肝郁血虚型失眠患者淡紫暗舌组（E）与白舌组（F）差异菌群对比（Wilcoxon，P ＜0.05）

使用Anosim 方法进行两两组比较分析，见图6-C，结果为紫暗舌组与淡白舌组相比，R值为0.169，p值为0.006。R值大于0表明两组样本组间差异大于组内差异，p值＜0.05 表明紫暗舌组与淡白舌组的组间差异具有显著性。随后，通过LDA Effect Size 分析观察两组中具有显著性差异的菌群构成，结果见图6-A。结果表明，紫暗舌组在罗斯氏菌属、微球菌科（Micrococcaceae）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）、奈瑟菌（Neisseria）、微黄奈瑟球菌（Neisseria_subflava）、变形菌门（Proteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）的LDA score显著高于淡白舌组；而淡白舌在拟杆菌门、拟杆菌纲（Bacteroidia）、拟杆菌目（Bacteroidales）、普氏菌科（Prevoltelaceae）、普氏菌属（Prevoltela）、产黑普氏菌（Prevoltela）、梭杆菌门 、梭 杆 菌 纲（Fusobacteriia）、梭 杆 菌 目（Fusobacteriales）、梭杆菌科（Fusobacteriaceae）、梭杆菌属、卟啉单胞菌科（Porphyromonadaceae）的LDA 值明显高于紫暗舌组。随后从系统进化的角度比较两组差异物种（见图6-B），紫暗舌组和淡白舌组的差异菌群在系统进化角度具有较大的特异性。

图5 紫暗舌组（E）与淡白舌组（F）的α多样性指数及PCA、PCoA降维分析

通过网络图，进一步分析紫暗舌组与淡白舌组优势物种的相关性情况。通过Spearman 相关性分析，将相关系数大于0.6 且p值小于0.05 的数据输入Cytoscape 软件，以完成结果的可视化展示（见图6-D）。网络图主要拟合了5 个优势菌群，分别是放线菌门、变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门。整个网络以正相关关系为主，厚壁菌门的OTU 单元占主导。放线菌门OTU_102（拟杆菌属）与OTU_1238（厚壁菌属）、OTU_1575（梭杆菌门属）的共现性指数较高；OTU_1323（梭杆菌属）OTU_738（变形菌属）共现性指数较高，表明这些微生物具有较强的正相关关系。而拟杆菌门OTU_730（变形菌属）与放线菌门OTU_1364（罗氏菌属）及OTU_42（奈瑟菌属）、OTU_548（链球菌属）呈现出较弱的负相关关系。

3 讨论

中医舌象作为中医舌诊的重要组成部分，是反映人体脏腑气血的重要指征，也是中医辨证论治的重要过程。中医认为心开窍于舌，舌象与失眠的不同证候类型联系密切。研究表明[13]，淡白舌的形成与红细胞数减少、蛋白缺失、组织水肿、舌面微循环充盈不足等有关；紫暗舌则往往提示体内血液流变学的改变,其形成机制与血氧饱和度下降、静脉瘀血、血流缓慢、血小板凝聚性升高等有关。

从门分类水平来看，两组样本的优势微生物为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、梭杆菌门；从属分类水平来看，两组样本的优势微生物为链球菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、普雷沃菌属、纤毛菌属。研究表明[14]，人类肠道菌群以厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门为主，其中拟杆菌、双歧杆菌、梭菌、消化链球菌属和奇异菌属等厌氧菌为优势物种。由此可知，口腔中优势物种与肠道菌群具有相似性。物种组成分析表明，从门分类水平来看，两组在厚壁菌门丰度最高，但差异不大，而在变形菌门、拟杆菌门及梭杆菌门差异较大。厚壁菌门的绝对优势丰度可以看出本研究测序结果符合菌群的分布规律。有研究表明，肥胖者肠道菌群中拟杆菌门、厚壁菌门的比例较之体质量正常者明显降低。梭杆菌属常见于消化道，是口腔中常见的共生菌，在口腔生物膜中起整合作用，可介由多种黏附素桥接生物膜中的微生物。变形菌门种类繁多，它是人体肠道菌群失调的微生物标志，微生态失调产生过程有可能干扰微生物群落的稳定性，变形菌门适应性会随之增强成为优势菌[15]。由此可知，舌淡白与舌紫暗与失眠患者口腔微生态失调相互反映，是机体出现疾病的标志物信号。

图6 A：紫暗舌组与淡白舌组LDA Effect Size分析

生物多样性分析结果表明，淡白舌组口腔菌群的α多样性指数略高于紫暗舌组，且差异具有显著性（p＜0.05）。PCA 降维表明，紫暗舌组样本可形成聚落，而淡白舌组样本相对分散，两组样本的分布可以找到明显的区分线。Anosim 分析表明两组样本组间差异大于组内差异，且具有显著性。紫暗舌组在罗斯氏菌属、微球菌科、奈瑟菌目、奈瑟菌科、奈瑟菌（Neisseria）、微黄奈瑟球菌、变形菌门、β-变形菌纲的LDA score 显著高于淡白舌组；而淡白舌在拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、普氏菌科、普氏菌属、产黑普氏菌、梭杆菌门、梭杆菌纲、梭杆菌目、梭杆菌科、梭杆菌属、卟啉单胞菌科的LDA 值明显高于紫暗舌组。尽管舌苔形成是多因素作用的结果[16]，但两组对比显著的生物多样性及菌群结构差异或许是导致舌象变化的重要原因。

中医舌象具有非常悠久的历史，中医舌象的客观化也是当前中医舌诊研究中的重点。本研究对肝郁血虚型失眠患者中的淡白舌与紫暗舌两种典型舌像进行口腔菌群对比研究，发现了两种中医舌象患者口腔微生态的生物多样性及菌群结构存在着显著性的差异。这为进一步揭示中医舌象与疾病的相关性提供了新的方法和思路，为进一步挖掘口腔微生态与中医舌象的关联性和生物标志物，并应用于临床的诊断与疗效预期判断提供研究借鉴。