利用信号网络的组合筛选方法鉴定植物抗旱基因（2020.7.7 Plant Biotechnology Journal）

联合国粮食及农业组织统计的数据显示，到2030年，20%以上的发展中国家将面临缺水问题。因此，农作物改良的重要目标之一是使作物具有耐旱性。植物水分利用效率（WUE）决定着植物应对土壤中度或重度缺水的能力，是植物在干旱胁迫下生存的主要因素，也是保证产量的关键因素。所以，提高植物水分利用率一直是作物抗旱育种中的主要目标。

维管植物抗旱性和水分利用效率的机制十分复杂。研究发现，包括光合作用的光反应、光合碳固定、植物激素和相关信号通路、气孔功能等多种生理过程和信号转导途径均参与其中。植物具有复杂的基础信号网络，该网络中各组分往往由大的基因家族编码，所以还存在着功能冗余现象，这使得信号通路的研究充满挑战。近日，德国马普所科研人员开发了一种基于综合网络选择的方法来鉴定增强抗逆性的基因组合，并应用此方法通过组合遗传转化技术，筛选在干旱环境下存活的植株，并通过检测生物量作为反映标准，成功筛选到了两个钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）基因家族成员在植物抗旱中的作用，研究结果发表在知名植物学期刊Plant Biotechnology Journal上，题为《Improving plant drought tolerance and growth under water limitation through combinatorial engineering of signaling networks》。

钙信号在真核生物中代表了一种古老的信号机制，调节细胞内钙浓度变化的主要蛋白家族之一是钙依赖性蛋白激酶（CDPKs），该家族参与了包括长期生长发育过程以及对非生物和生物应激刺激的短期快速信号反应等生物过程。因为植物胁迫相关钙信号的启动和传播通常发生在质膜上，所以作者选首先在拟南芥中筛选了15个位于质膜CPKs，分别构建了15个重组质粒，另外构建了用于卡那霉素转基因株系筛选的含有nptII的重组质粒，将16种质粒混合并使用基因枪轰击转化烟草。通过组合转化试验和大规模筛选转基因株系，共获得450多株卡那霉素抗性的转基因株系，排除生长发育异常、低育性的株系后，103个株系被用来收获的T1种子用于随后的筛选。在干旱处理后分别在23天和7天统计存活率，筛选证实了其中9个株系的耐旱性。然后，作者检测了9个株系中转化的基因和基因组合：与ABA信号和气孔关闭有关的CPK3和CPK30分别在四个株系中检测到;与耐生物胁迫相关的CPK5也在四个株系中检测到;而出现频率最高的是CPK28和CPK29，两个基因均出现了5次，且在4个株系中同时出现。在以往研究中，CPK28和CPK29均未涉及非生物胁迫反应。

接下来，作者对这两个基因的功能进行了验证。作者分别获得了拟南芥和高生物量作物烟草的单独超量表达CPK28和CPK29的株系和同时超量表达CPK28/29的株系，通过耐旱性实验、渗透胁迫实验表明同时超量表达CPK28/29的株系存活率显著提高，而过表达单基因的株系与野生型没有显著差异，这一结果清楚地证明了这两个基因同时出现在筛选的抗旱性组合转化群体中的功能意义。同时，N-28/29株系在盐胁迫下表现出更高的发芽率和生长量，表明CPK28和CPK29共表达的有益影响也可以扩展到具有渗透机制的其他非生物胁迫。另外，作者证明了在适度水分限制条件下，N-28/29生物量积累比对照显著增加，并表现出更强的水分利用效率。而对适度水分亏缺的耐受性是一个重要的农艺性状，该结果表明了CPK28和CPK29在生产上的利用价值。最后，作者证明N-28/29植物对油菜甾体生物合成抑制剂BRZ的敏感性较低，表明这两种钙依赖性激酶的共表达刺激油菜素甾体信号，并通过这种方式提高水分限制条件下的耐旱性。

最后，为了证明该组合方法在分离复杂信号网络和解剖大基因家族功能上的普遍適用性，作者又利用此方法成功筛选到了CPK基因家族中的CPK5对于盐胁迫耐受的功能，并验证了CPK5的转基因株系表现明显优于对照植株。该研究展示了一种高效的组合筛选、转化的体系来鉴定复杂信号通路中的功能基因或基因组合，为功能基因的研究提供了新的方法和思路。