脓毒症大鼠心功能及氧化应激水平变化

王 臻，秦文娟，翟子敬，黄 磊，董珊珊，郭雪婷，张彩云，王 忠，芦桂林*

(1.石河子大学医学院临床医学系，新疆 石河子 832008；2.石河子大学医学院第一附属医院超声医学科，3.心内二科，新疆 石河子 832008)

脓毒症为病死率较高的全身感染性疾病，心脏是其最易累及器官之一。脓毒症与心肌抑制关系密切，可引起心脏结构改变，导致心力衰竭[1]，其主要机制可能为氧自由基过量产生，引发氧化应激和细胞凋亡等连锁反应[2]。本研究观察脓毒症大鼠心脏超声表现及心肌组织病理学变化，测定心肌组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)及丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，探讨氧化应激与脓毒症心肌损害的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 48只12周龄SPF级雄性SD大鼠，由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供，生产许可证SCXK(新)2011-0004，随机均分为空白对照组(Blank组)、假手术组(Sham组)、脓毒症24 h组(CLP24 h组)及脓毒症48 h组(CLP48 h组)，每组12只，于20～25℃室温下分笼饲养，予标准饲料，自由采食进水。

以盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture, CLP)制作脓毒症模型，检查时间分别为造模后24 h(CLP24 h组)和48 h(CLP48 h组)。术前停饲12 h。消毒、铺巾，经腹腔麻醉后，于下腹部做长约2 cm正中切口，打开腹腔分离肠系膜，用无菌丝线结扎盲肠远端1/2处，以无菌针头贯通穿刺中央部分2次，挤出粪便证明穿孔成功后关闭腹腔。对Sham组仅开腹分离盲肠远端及肠系膜后关腹，Blank组不施加干预。术后按50 ml/kg体质量补充生理盐水，常温饲养，自由采食进水。

1.2 仪器与方法 腹腔麻醉大鼠后，以左侧卧位保定于检查台上，连接心电图。采用GE Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，12S心脏探头，探头频率12 MHz，采集胸骨旁左心室长轴切面(测量M型曲线)、左心室短轴切面连续10个心动周期的动态图像，分别测量左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、室间隔舒张末期厚度(interventricular septum thickness at end-diastole, IVSD)、左心室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall depth at end-diastole, LVPWD)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening, LVFS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)及心率(heart rate, HR)。

1.3 大鼠心肌标本制备及染色 造模48 h后，于CLP24 h组、Sham组及Blank组中各随机选取6只大鼠，麻醉后摘取心脏，以4%多聚甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后沿心脏短轴切片，厚度5 μm；二甲苯脱蜡，反复水洗后常规HE染色，在高倍光学显微镜下观察心肌细胞形态学变化。以Weigert铁苏木精液对心肌组织切片染色5～10 min，之后充分水洗，并将切片置于Masson丽春红酸性复红液中8 min，以冰醋酸水溶液浸洗后置入磷钨酸，以苯胺蓝或光绿液染色5 min，脱水至透明后封片，于倒置显微镜下观察心肌间质胶原纤维分布情况。造模72 h后于CLP48 h组随机选取6只大鼠，重复上述操作。

1.4 检测心肌组织SOD、GSH和MDA水平 将各组剩余6只大鼠深度麻醉后处死，开胸摘取心脏后剪碎心肌组织，以超声机粉碎制成10%心肌组织匀浆液，1 000 r/min离心10 min后取上清液，分别采用SOD、GSH及MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测SOD活力、GSH及MDA水平，重复3次，取平均值[3]。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。以±s表示符合正态分布的计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，2组间比较采用t检验。采用Graphpad Prism 8.0制作散点图，并进行Spearman相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 Blank组大鼠精神佳，行动敏捷，对刺激反应强，自由采食进水。Sham组大鼠精神尚可，活动次数、采食进水次数减少。CLP24 h组大鼠行动迟缓，精神萎靡，对刺激反应减弱，呼吸急促，出现腹泻。CLP48 h组大鼠嗜睡，不活动，背毛竖起，严重稀水样便，不采食。

2.2 超声心动图 4组间LVEDD、IVSD、LVFS、LVEF及HR差异均有统计学意义(P均<0.01)，其中LVFS、LVEF及HR在Blank组>Sham组>CLP24 h组>CLP48 h组(两两比较P均<0.05)；CLP24 h组IVSD高于Blank组和Sham组，CLP48 h组IVSD高于其他3组(P均<0.05)，CLP48 h组LVEDD高于Blank组(P<0.05)。见表1、图1。

图1 大鼠超声心动图 A.Blank组(IVS:室间隔，LV:左心室，LVPW:左心室后壁，RV:右心室，AO:主动脉，LA:左心房)； B、C.CLP48 h组，室壁增厚并心包积液(B)，二尖瓣少量反流(C，箭)(PE：心包积液,MI:二尖瓣反流)

表1 4组大鼠超声心动图参数比较(±s，n=12)

表1 4组大鼠超声心动图参数比较(±s，n=12)

组别LVIDD(mm)IVSD(mm)LVPWD(mm)LVFS(%)LVEF(%)HR(bpm)CLP48 h组5.11±0.17*1.79±0.04*#&1.90±0.16*#35.60±1.73*#&65.11±3.39*#&144.27±11.89*#&CLP24 h组4.87±0.151.64±0.79*#1.82±0.1540.88±0.66*#74.76±1.41*#264.66±18.00*#Sham组4.81±0.151.57±0.111.76±0.1544.29±0.84*80.56±1.07*359.58±14.68Blank组4.83±0.181.58±0.091.77±0.1149.34±1.2383.79±1.69368.83±14.46F值8.4217.532.13282.35183.64590.72P值<0.01<0.010.11<0.01<0.01<0.01

注：*：与Blank组比较，P<0.05；#：与Sham组比较，P<0.05；&：与CLP24 h组比较，P<0.05

2.3 心肌组织HE染色 HE染色示Blank组及Sham组大鼠心肌细胞排列整齐，大小均一，横纹结构清晰，胞浆染色均匀。CLP24 h组和CLP48 h组心肌细胞排列紊乱，部分心肌细胞肿胀明显并有坏死灶出现，胞浆染色加深，细胞核浓缩深染，心肌细胞中的肌原纤维和水肿性心肌纤维排列松散并见炎性细胞浸润，CLP48 h组上述变化更显著。见图2。

图2 大鼠心肌组织HE染色(×200) A.Blank组； B.Sham组； C.CLP24 h组； D.CLP48 h 组，右心室内可见血凝块

2.4 心肌组织Masson染色 Blank组及Sham组心肌间隙较窄，心肌细胞间见少量胶原纤维分布，蓝色淡染。CLP24 h组和CLP 48 h组大鼠心肌细胞明显肿大、排列紊乱，且部分心肌间质及血管旁心肌间隙中胶原纤维明显增多，呈栅栏样排列，心肌间距增宽；CLP 48 h组上述变化更显著。见图3。

图3 大鼠心肌组织Masson染色 A.Blank组(×100)； B.Sham组(×200)； C.CLP24 h组(×100)； D.CLP48 h 组(×200)

2.5 心肌组织SOD、GSH、MDA水平 SOD、GSH在Blank组>Sham组>CLP24 h>CLP48 h组；MDA在Blank组

表2 4组大鼠心肌组织SOD、GSH、MDA水平比较(U/mgprot，±s，n=6)

表2 4组大鼠心肌组织SOD、GSH、MDA水平比较(U/mgprot，±s，n=6)

组别SODGSHMDACLP48 h组71.83±7.54*#&5.11±0.93*#&68.48±1.92*#&CLP24 h组139.33±3.14*#9.63±0.79*#47.53±1.88*#Sham组180.16±2.63*16.93±0.27*20.83±0.79*Blank组188.50±4.2319.35±0.3017.15±0.83F值742.80618.161 633.76P值<0.01<0.01<0.01

注：*：与Blank组比较，P<0.05；#：与Sham组比较，P<0.05；&：与CLP24 h组比较，P<0.05

2.6 心肌组织SOD、GSH、MDA与LVEF的相关性 对大鼠(n=24)LVEF与氧化应激指标进行相关性分析，结果显示LVEF与SOD、GSH呈正相关 (r=0.922 6、0.938 0，P均<0.001)，与MDA呈负相关(r=-0.929 8，P<0.001)。见图4。

图4 大鼠心肌组织SOD(A)、GSH(B)、MDA(C)与LVEF的相关性散点图

3 讨论

心功能障碍是脓毒症患者死亡的常见原因。本研究脓毒症大鼠在造模后出现嗜睡、活动减少、对刺激反应减弱及稀水样便，心脏超声显示左心室收缩功能降低，左心室室腔扩大，室壁及室间隔增厚；病理提示心肌细胞肿大坏死，炎性细胞浸润，右心室甚至出现血凝块，证明造模成功[4]，且随造模时间延长，心肌受损逐渐加重。

超声心动图显示，随脓毒症造模时间延长，大鼠LVEF、LVFS显著降低，室壁运动幅度逐渐减弱，室壁厚度增加，左心室室腔增大，HR逐渐降低。脓毒症发生时，机体释放大量炎性因子。研究[5]表明心脏局部释放的炎性因子参与调控心脏重构过程；心肌重构除表现为心肌肥厚、心肌细胞肿大外，还可见心肌间质纤维化和胶原纤维增多。本研究发现脓毒症大鼠心肌组织主要病理表现为心肌细胞肿大，并可见空泡样变，伴大量炎性细胞浸润，心肌间隙增宽并排列紊乱，其间胶原纤维明显增多，染色加深，提示脓毒症状态诱发了心肌重构过程。脓毒症作为一种急性全身性炎症，可导致心脏成纤维细胞异常活化，快速出现病理性纤维化[6]。CLP48 h组大鼠心肌可见显著纤维化。

脓毒症时过度产生自由基，大量消耗抗氧化剂，使氧化与抗氧化因子失衡；而心肌细胞氧化应激反应是脓毒症诱导心肌损害的标志，内源性抗氧化剂活性增强则具有显著心脏保护作用[7-8]。氧化应激过程中产生大量活性氧，导致蛋白、DNA及脂类发生过氧化反应，破坏细胞膜的完整性，引起细胞凋亡，而心肌细胞凋亡同样为脓毒症心肌损害的显著特征之一[9]。SOD和MDA活性水平是评估自由基代谢的主要参数。SOD是重要的抗氧化酶，可清除氧自由基，将超氧自由基转化为过氧化氢，并将其代谢为水和氧气等对机体无害的物质[10]。MDA是氧化损伤标志物，通常用于评估生物体内脂质过氧化程度[11]。GSH为抗氧化应激过程中的重要角色，能有效清除氧化应激反应中的氧化物质，而ROS可使蛋白质错误折叠，导致GSH大量消耗[12]。本研究发现脓毒症大鼠心肌组织SOD、GSH水平明显下降，MDA水平明显增加，提示脓毒症时脂质过氧化反应增强，氧自由基大量增加，并已超出机体自身的清除能力。既往研究[13]表明抗氧化剂疗法靶向信号传导可预防脓毒症致心肌损害。本研究结果显示大鼠LVEF与SOD、GSH、MDA均具有较强相关性(r均>0.90)，进一步提示氧化应激在脓毒症心肌损害形成过程中发挥重要作用，抗氧化应激反应措施或可有效预防脓毒症早期心肌损害。

综上所述，脓毒症对大鼠心脏结构和功能均产生严重损害，氧化应激可能是其重要机制。