利用“蓝白斑筛选”高效融合微生物学和基因工程实验*

孙 娟 赵逸欧 刘长付

（1 北京市第五十七中学 北京 100038 2 首都师范大学附属回龙观育新学校 北京 102208 3 北京市第五中学 北京 100007）

高中阶段，选修生物学的学生在实验上需要更多的学习和实践，其中包括培养基的配制、无菌操作、微生物的培养和分离、微生物的计数、微生物的鉴定［1］等基础实验。在基因工程实验学习中，还涉及限制酶切割DNA、DNA 的连接、大肠杆菌的转化和筛选［2］等实验操作。学生在学习中，很多实验都是做完抛之脑后，甚至有些实验仍处于纸上谈兵阶段。因此，在学习中保持知识的连贯性，并学以致用非常重要。文献调查显示，“蓝白斑筛选实验” 可有效地贯穿以上知识和实验内容［3－4］，以一个完整的大实验形成科技实践活动。通过实践，可促进学生掌握知识，提高能力，提升科学素养。

1 实验原理

细菌细胞吸收外源DNA 并发生可遗传的改变，称为转化。通过Ca2+处理的化学方法诱导大肠杆菌进入感受态，有利于外源DNA 进入细菌内［3］。

β－半乳糖苷酶可使显色底物X－Gal 分解为蓝色，使菌落呈现蓝色；若有外源DNA 片段插入至载体中，则β－半乳糖苷酶基因失活，从而产生白色菌落［3－4］。

2 实验材料和仪器

2.1 材料：受体菌JM109（需在－80℃保存，或在干冰中短时间保存），pMD19－T 载体试剂盒、ITPG溶液、X－Gal、NaCl、琼脂、酵母粉、蛋白胨、冰、烧杯、锥形瓶、玻璃棒、移液器、离心管、培养皿等。

2.2 仪器：恒温培养箱、恒温摇床、离心机、搅拌器、冰箱等。

3 实验步骤

1）将ITPG 和X－Gal 配制为溶液，除菌后冷冻保存，备用。

2）制备LB 液体培养基、LB 固体培养基、含氨苄青霉素（标记为Amp+）的LB 固体培养基，备用。

3）重组质粒的制备：实验组按照下表配制反应体系，使Insert DNA 与pMD19－T 载体（质粒）连接；对照组将表1 中的Control Insert 替换为等量蒸馏水，其他条件相同。

表1 pMD19-T 中插入Insert DNA 的反应体系

4）将质粒转化至大肠杆菌：将实验组和对照组的产物分别转入感受态大肠杆菌中。①取出2管受体菌置于冰上融化；②冰上操作，将步骤3的反应产物分别与受体菌轻打混匀，冰上放置30 min；③热激法转化：将离心管放置于42℃水浴，热激90 s，转化中勿摇动离心管；④将离心管转移至冰浴，放置1～2 min；⑤每管加400 μL LB 液体培养基，在37℃摇床缓慢摇动培养45 min，使细菌复苏。

5）制备含ITPG、X－Gal 的培养基（现用现制）：取适量ITPG、X－Gal 溶液均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基表面，晾干。

6）涂板：取100 μL 步骤4 获得的转化细菌分别涂布于添加IPTG、X－Gal 的培养基表面，37℃恒温培养箱倒置培养12 h。

7）观察：实验组和对照组经转化后的大肠杆菌菌落呈现出不同的颜色，若显色不明显，可将平板置于4℃培养2～4 h 后再观察，分别统计实验组、对照组中的蓝斑和白斑数目。

4 结果与讨论

按照以上步骤完成蓝白斑筛选实验后，需进一步根据菌落的颜色和数目计算重组效率，实验结果如图1（本文附图见封四）所示。在实验组里，外源DNA 与T 载体连接成功的会破坏β－半乳糖苷酶基因的表达，理论上应都应呈现白斑，但实际结果是仍有少量蓝斑存在，推测其原因可能是T载体发生自连。但是，重组效率为93%可表明，重组比较成功。对照组只加入了T 载体，理论上不会产生白斑，然而实际上仍有白斑出现，因此，推测T 载体发生自连时，其末端的部分脱氧核苷酸脱落，使连接后的阅读区发生改变，从而改变mRNA 的序列，导致蛋白质结构变化，最终引起性状差异。

5 小结

通过蓝白斑筛选实验，培养基的配制、灭菌、无菌操作、DNA 的连接、菌落的计数等不再是孤立的实验步骤，而是服务于一个大的实验目的“通过外源基因的导入，使大肠杆菌发生转化，最终产生白色的菌落”。在“蓝白斑筛选”科技实践活动中，知识学习更加系统化、能力提升更加全面化，实验结果的分析和讨论还能提高学生的思辨能力，从而全方位提升学生的学科素养和综合素养。