华北地区水产用光合细菌液体制剂的优势菌属分析

文/张洪玉 王海波 夏磊 焦丽亭 赵明军

为了解目前水产用光合细菌液体制剂优势菌属的实际情况，从华北地区养殖户和水产动保产品销售商处采集了12种典型菌剂，运用16S高通量测序分析菌群组成，去除非光合细菌数据，进而统计光合细菌的百分构成比。结果显示，水产用光合细菌液体制剂中最常见的菌属是紫硫细菌的外硫红螺菌，而不是紫非硫细菌的红假单胞菌。生产厂家、管理机构和研究人员应根据光合细菌制剂菌种的实际情况开展相应的工作。

光合细菌是一类能进行不产氧光合作用的微生物的总称，其较新的分类和命名参见《伯杰氏系统细菌学手册》第二版。光合细菌制剂是水产养殖常用的益生菌制剂之一，通常使用的菌种是紫非硫细菌（purple nonsulfur bacteria，PNSB）中的沼泽红假单胞菌（rhodopseudomonas palustris）。原农业部公布的《饲料添加剂品种目录（2013）》中，光合细菌菌种仅有沼泽红假单胞菌。现行有效的两个光合细菌菌剂标准NY 527-2002和SN/T 3542-2013也只适用于沼泽红假单胞菌或以其为代表的PNSB。对于光合细菌固定化技术、检测技术和在水产养殖应用的研究也主要集中在以沼泽红假单胞菌为代表的PNSB上。

但是，我们在工作中发现，实际销售和使用的光合细菌产品最常检出的菌种并非红假单胞菌。为明确水产用光合细菌液体制剂中的菌种情况，我们开展了对光合细菌产品菌种的检测和分析工作，以期为光合细菌制剂的生产、管理和研发提供数据支持。

一、材料与方法

（一）实验材料

从华北地区养殖户和水产动保产品销售商处采集典型的光合细菌产品12个，编号P1～P12。其中，仅3个产品（P3，P5和P12）标识了菌种名称，为沼泽红假单胞菌。12个菌剂来自12个不同厂家，厂家地址分布情况为：北京市3个（P1，P9和P10），河南省3个（P4，P6和P7），江苏省2个（P3和P5），广东省2个（P8和P11），山东省1个（P2），湖南省1个（P12）。

（二）实验方法

1.高通量测序分析菌群结构

产品摇匀开封后，取1mL菌液，离心收集菌体，干冰运输，由生工生物工程（上海）股份有限公司提取DNA并进行16S V3～V4区扩增和高通量测序，所用引物为通用引物341F和805R。

2.产品中不同光合细菌构成比分析

以高通量测序结果为原始资料。选取每个菌剂丰度前11的菌属，查阅《伯杰氏系统细菌学手册》第二版和相关文献，12个菌剂中共有9个属的光合细菌，分别是：红假单胞菌（rhodopseudomonas），外硫红螺菌（ectothiorhodospira），rhodobacter，thioflavicoccus，rhodovulum，rubribacterium，ectothiorhodosinus，allochromatium和thiorhodococcus。在原始分类学报告中检索每个产品这9个属光合细菌占总菌数的比例，以总光合细菌数量为100%，重新计算光合细菌菌属的百分构成比。

二、结果

以12个菌剂的高通量测序结果为原始资料，排除非光合细菌的数据，计算每个菌剂中光合细菌的百分构成比（表1）。结果显示，菌剂中优势菌属为红假单胞菌的仅占25%，为外硫红螺菌的占58.3%，为rhodobacter和thiorhodococcus的各占8.3%。分析12个菌剂中含量在1%以上的菌属，红假单胞菌和外硫红螺菌分别在33.3%和83.8%的菌剂中含量超过1%。可见，菌剂中最常见的菌属是紫硫细菌（purple sulfur bacteria，PSB）的外硫红螺菌，而不是PNSB的红假单胞菌。

表1 菌剂中光合细菌菌属的百分构成比

三、讨论

（一）水产用液体光合细菌制剂的抽样

从华北地区养殖户和销售商处采集典型的光合细菌产品12个，覆盖了河北、天津、北京主要养殖区，包括海水养殖及淡水池塘养殖。虽然我们尽量选择了有代表性的菌剂产品进行了抽样检测，但仍有必要进一步增加样本数量、扩大采样区域以减小得出错误结论的可能性。

（二）16S扩增子高通量测序研究菌剂菌群结构

尽管光合细菌的生产工艺较为简单，但相较芽孢菌和乳酸菌，光合细菌的纯培养和活菌计数技术还是较为困难，特别是在活菌数不高的情况。现行有效的两个光合细菌菌剂标准NY 527-2002和SN/T 3542-2013采用的是基于培养的计数方法，且只适用于沼泽红假单胞菌或以其为代表的PNSB。较之传统培养方法，基于PCR的高通量测序更适合研究菌剂的菌群结构。使用通用引物可以有效地检出绝大部分种类的原核生物，避免了培养法的选择性带来的检测不出的可能。且基于PCR的方法不区分死菌和活菌，即使活菌数较低，只要死菌的DNA没有严重降解，就可以被检出，能够更好地反应出菌剂中真正的优势菌群。随着高通量测序技术的普及，测序速度不断增加、成本则不断下降，且该方法无需繁琐的培养操作，大大节约了实验人员的时间。

（三）光合细菌制剂的优势菌属

《饲料添加剂品种目录（2013）》的光合细菌仅沼泽红假单胞菌一种，光合细菌菌剂标准NY 527-2002和SN/T 3542-2013也仅适用于沼泽红假单胞菌或以其为代表的PNSB。对于光合细菌固定化技术、检测技术和在水产养殖应用的研究也主要集中在以沼泽红假单胞菌为代表的PNSB上。而我们的研究结果显示，目前华北地区水产养殖使用的液体光合细菌菌剂的优势菌属是PSB的外硫红螺菌。PSB和PNSB是两群差异较大、进化距离较远的光合细菌群，分别位于γ变形菌纲和α、β变形菌纲。两群细菌在硫化物耐受程度、有机物利用能力、氧气耐受及利用能力、嗜盐性等方面存在较大差异。隶属于PSB的外硫红螺菌的多数种进行厌氧光能自养或利用有限的几种有机物进行光能异养、嗜盐、嗜碱、不需要生长因子，而属于PNSB的红假单胞菌则倾向于厌氧光能异养或微需氧到有氧化能异养、喜接近中性的淡水、部分种属需要生长因子。鉴于二者在系统发育和生理上存在较大区别，而目前光合细菌制剂的优势菌属已不再是红假单胞菌，而是外硫红螺菌，研究人员应该更多的关注该菌属的培养、检测手段和功能研究，以适应实际生产的需要。同时，生产厂家应注重产品菌种的鉴定、严把产品质量关。此外，管理部门则应结合实际规范光合细菌制剂的菌种、出台配套的检验标准以适应不断变化的微生物制剂市场。

综上所述，目前华北地区水产用光合细菌液体制剂中最常见的菌属是PSB的外硫红螺菌，而不是PNSB的红假单胞菌。生产厂家、管理机构和研究人员应根据光合细菌制剂菌种的实际情况开展相应的工作。