基于性质分析建立HBc-VLP的高效纯化技术

仲为铮 吴官梓 于贝禾

HBc-VLP由于其自身结构与免疫原性的显著优势而被广泛研究，具有很大的应用前景，规模化制备技术却一直是阻碍其发展和应用的瓶颈。常用的密度梯度离心由于处理量、时间长、成本高等只能用于实验室规模的研究，而基于色谱技术的纯化方法只有少数形成了完整的工艺，但收率低。同时，色谱技术主要集中在离子交换层析的研究，但是，大肠杆菌表达体系中，许多宿主蛋白和HBc-VLP与离子交换填料具有比较相近的亲和力，会在一定程度上影响离子层析的效率，且离子交换层析中蛋白与填料间相互作用力较强，容易导致目的蛋白难以洗脱甚至发生结构的变化而失去免疫原性。为了解决HBc-VLP现有纯化工艺收率、纯度等各方面存在的不足，本研究立足HBc-VLP的颗粒结构与表面性质，通过分析发现HBc-VLP颗粒表面的突起区域含有较多的疏水性氨基酸，组成了一个个疏水性区域，赋予HBc-VLP表面较强的疏水性，因此发展了疏水层析为基础的纯化方法。

1. 蛋白的诱导表达

用培养基将菌种活化，然后在培养箱中37℃下培养直至长出单菌落 ，之后进行一级扩增培养，最后蛋白诱导表达

2.菌体的收集与破碎

将菌体离心收集后，进行超声菌体破碎，然后弃去细胞碎片等沉淀，保留上清。

3.疏水层析纯化HBc-VLP

取10 mL Butyl-S介质，装柱，平衡缓冲液平衡十个柱体积。 60℃温度处理30 min后的细菌破碎液上清30 mL，调节硫酸铵浓度为0.5 M，pH为7.0，上样，用平衡缓冲液淋洗至基线走平并收集穿透组分。然后用不含硫酸铵的洗脱液进行洗脱，洗脱后收集。

4. 凝膠过滤层析精制HBc-VLP

疏水层析洗脱收集的15 mL洗脱液用100 kDa的超滤浓缩管进行浓缩，预装柱预先用含0.15M NaCl 的20mM PB缓冲液平衡，将浓缩后的5 mL浓缩样品上样，分离后收集。

5.蛋白质浓度测定

蛋白浓度检测根据 Bradford 的方法进行测定：

取 100 μL 样品加入到G-250工作液中测定 595 nm 处的吸光值，带入标准曲线方程即可计算得到样品中的蛋白质浓度。

6. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

样品与 5×的上样缓冲液按照 4：1 的比例混合，100℃处理 5 min。 根据具体实验要求取一定体积（< 30 μL）的处理后样品用于电泳分析。

将处理后的样品加入到电泳胶的样品槽中。电泳仪初始电压一般设置为90 V。 待样品进入分离胶，电压可改为 120-160 V 运行，直至标示物溴酚蓝迁移出电泳胶。 小心剥下电泳胶，准备染色。

考马斯亮蓝染色液的配制：称取1 g考马斯亮蓝 R250 于450 mL的乙醇中，充分溶解。之后加入100 mL乙酸，搅拌混合，去离子水定容至1000 mL。

染色：将电泳后剥离的电泳胶放入染色液中，确保染色液充分覆盖胶面。水平摇床上室温下缓慢摇动，直至充分染色。

染色液倒出后用去离子水清洗电泳胶。加入适量脱色液后，水平摇床上缓慢摇动，室温脱色， 期间根据实际情况更换脱色液。当电泳胶蓝色背景基本脱除，蛋白条带清晰即可停止脱色。更换电泳胶至去离子水中进行图像采集，或更换至含甘油的保存液保存。

7.高效液相色谱分析

高效液相色谱分析使用 Agilent 1100系统。 TSK G5000 PWXL色谱柱。流动相为50 mM磷酸缓冲液。进样体积为 100 μL，流速设定0.5 mL/min，UV 检测器的设置检测波长为 260 nm 和280 nm。

8.透射电镜分析

密度梯度离心法纯化得到的HBc-VLP及衍生物的颗粒形貌由FEI Tecnai 20透射电子显微镜检测。在400目铜网上滴加少量样品后1%乙酸双氧铀染色，水洗脱盐干燥后观测即可。

9.最后得出结论

此次研究的创新点便在操作过程中，我们打破了传统的高速离心方法，采用光谱技术。光谱技术操作简单，易于蛋白质活性，保持应用范围广，分离效率高。这不仅仅是简单的创新，更是科技技术上的伟大创造。

通过这次科学实践，我们学到了细菌培养实践操作，蛋白质的分离纯化，蛋白质的离心浓缩，蛋白质浓度的检测技术，蛋白质纯度的检测技术等。