新型抗菌肽Temporin-SHf在毕赤酵母中的表达及诱导条件优化

王莲哲，江宏浩，唐宜飞，洪军

(河南城建学院，河南 平顶山，467000)

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一类抗菌谱广、耐热性较强、不易产生耐药性的小分子多肽，作为抗生素替代品具有良好的应用前景[1-2]。抗菌肽在自然界中分布广泛，在动植物及细菌、病毒当中都有发现。目前已经从自然界中发现并分离了2 600多种抗菌肽，并在其制备、抗菌活性、作用机理研究等方面取得了巨大的进展[3]。抗菌肽的分子质量比较小，一般由12～50个氨基酸组成，属于机体天然免疫系统的重要组成部分。两栖类动物的表面皮肤腺体分泌的一系列抗菌肽有明显的抑菌效果，具有潜在应用价值[4]。其中Temporin抗菌肽是目前发现的最小的抗菌肽，已从不同的两栖类中分离出20多种，均表现出良好的抑菌活性[5]。海南产沼蛙皮肤Temporin对革兰氏阳性菌和阴性菌均有很好的抑菌效果[6]，源于Temporin-Pta的杂合肽HX-12A对大肠杆菌等细菌有较高的蛋白酶活稳定性抑制作用，Temporin B还有抗病毒活性[7-8]。

尽管Temporin抗菌肽有良好的抗菌活性，但其真核表达少有报道。采用基因工程手段将抗菌肽在微生物中表达是实现其大规模生产的基础。目前已有很多其他物种来源的抗菌肽实现了重组表达[9-10]。本项目以新型抗菌肽Temporin-SHf为目标，采用基因工程的方式，实现抗菌肽Temporin-SHf真核表达，分析体外抑菌活性并优化诱导条件，为后期获取低成本，高效的新型抗菌肽制剂提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 质粒及菌株

毕赤酵母菌GS115，毕赤酵母表达载体pPIC9K，大肠杆菌(EscherichiacoliATCC25922)，金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923)等，为实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 抗菌肽基因合成与表达载体构建

按照抗菌肽数据库中已经公布的抗菌肽Temporin-SHf序列(AP02856)，选用毕赤酵母偏爱密码子设计优化抗菌肽的基因序列，并在其5′端添加EcoR I酶切位点，起始密码ATG及Kex2酶切位点。在其3′端添加终止密码子和NotI 酶切位点；该目的基因命名为Temporin-SHf，序列由武汉金开瑞有限公司合成，分别为：Temporin-F：CGGAATTCATGAAAAGATGGTGGTGGTTGAGAAAGATTTGG，Temporin-R：ATT-TGCGGCCGCTCACCAAATCTTTCTCAACCACCAC CA。将上下游引物通过热退火合成基因序列。经EcoR I/NotI双酶切后与pPIC9K质粒经 T4连接酶16 ℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5α，涂布于质量浓度为50 mg/L氨苄青霉素的 LB 琼脂板，过夜培养后挑取单菌落，菌落PCR鉴定。鉴定用上游引物为5′AOX:GACTGGTTCCAATTGACAAG，下游引物为Temporin-R。PCR扩增反应条件为98 ℃预变性5 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经质量浓度为12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，阳性菌送武汉金开瑞公司测序验证。

1.2.2 酵母转化及筛选

从测序成功的菌液中提取重组质粒，用SalI酶切线性化并电转毕赤酵母(GS115)感受态，涂布基础葡萄糖培养基(minimal dextrose，MD)平板，30 ℃培养2～3 d。并用质量浓度为2 g/L G418筛选多拷贝菌株。筛选10个多拷贝转化子，用试剂盒提取酵母基因组DNA为模板，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定，反应条件及引物同1.2.1。以空载体pPIC9K转化酵母菌GS115做负对照。

1.2.3 酵母菌反转录PCR(reverse transcrtion polymerase china reaction，RT-PCR)检测

取重组酵母菌液，经酸洗玻璃珠法破碎细胞，用酵母菌RNA提取试剂盒提RNA，由反转录试剂盒(天根生物)反转录为cDNA第1条链，以此为模板，用特异性引物进行RT-PCR扩增，扩增引物为：Temporin-RT-F：GAATTCATGAAAAGATGGTGG，下游引物Temporin-RT-R：GCGGCCGCTCACCAAA，反应条件同1.2.1。

1.2.4 工程菌的诱导表达及优化

挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达。取1 mL菌液接种于50 mL BMGY培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养至OD600为2～6，4 ℃，6 000 r/min离心5 min，收集菌体重悬于50 mL BMMY培养基，转入250 mL锥形瓶振荡培养，甲醇诱导表达，对甲醇添加量(体积分数0.5%、1%、1.5%)，温度(28、30、32 ℃)，诱导起始浓度(OD600=0.5、1、1.5)进行优化。每隔24 h加1次甲醇，在诱导的24、48、72、96、120 h取上清用考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量，用转空载体的酵母菌株做负对照，抗菌肽蛋白含量用阳性菌分泌蛋白量减去空载体负对照分泌蛋白量。同时用不同诱导条件下的发酵上清液做抑菌实验，用大肠杆菌做指示菌，用抑菌圈直径(含打孔径)表示抑菌活性，3组平行实验统计数据并作图。

1.2.5 抗菌肽抑菌活性分析

用蛋白质量浓度最高的上清液做抑菌活性实验。采用琼脂孔穴扩散法进行抑菌分析。用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌为指示菌，取培养至对数生长期指示菌悬液80 μL，涂布于LB固体培养基平板，待其凝固后用无菌打孔器(直径5 mm)打孔，在孔中分别加入重组毕赤酵母转化子诱导表达上清100 μL，37 ℃过夜培养，观察并拍照。用含pPIC9K空载体的转化子的培养液上清100 μL同上处理作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 重组表达载体鉴定及序列分析

新型抗菌肽Temporin-SHf氨基酸序列为WWWLRKIW，是8个氨基酸的小肽，分子质量1 273 Da，等电点11，亲水系数-0.463，是亲水性小肽。将合成的基因通过酶切位点EcoR I和NotI连接在pPIC9K质粒中，转化大肠杆菌，进行菌落PCR鉴定(图1)。菌落PCR用载体上5′AOX上游引物，扩增片段在450 bp左右。阳性转化子送基因测序，结果正确，重组载体构建成功。测序结果序列及对应氨基酸序列如图2所示，序列上游添加了起始密码子ATG以及信号肽切割位点Kex2，下游添加了终止密码子，用以在分泌表达过程切除信号肽，产生完整的小肽。

M-marker DL2000;1-大肠杆菌转化子菌落PCR图1 重组质粒菌落PCR鉴定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

2.2 酵母转化及鉴定

将重组表达载体转化毕赤酵母感受态细胞，MD平板筛选。并用质量浓度为2 g/L G418筛选多拷贝菌株，提取基因组DNA进行外源基因的PCR鉴定。阳性菌株提取酵母RNA，通过RT-PCR验证目的基因的表达(图3)。结果表明，重组质粒pPIC9K-Temporin-SHf已经成功转入酵母菌GS115，并能够稳定表达。

M-marker DL2000;1～3-酵母菌转化子PCR鉴定;4～6-酵母菌转化子RT-PCRA-PCR鉴定；B-RT-PCR鉴定图3 重组酵母菌PCR鉴定和RT-PCR鉴定Fig.3 PCR identification and RT-PCR identification of recombinant yeast

2.3 抗菌肽的诱导表达及条件优化

将导入目的基因的重组菌株进行诱导表达，分别对温度，甲醇添加量(体积分数)和起始菌体浓度进行优化。在24、48、72、96、120 h取1次上清，用考马斯亮蓝法测定分泌蛋白质量浓度。以转空载体的酵母菌为阴性对照以去除背景蛋白量。同时以不同诱导条件下的上清液做抑菌实验，用抑菌圈直径反映分泌重组抗菌肽的抑菌活性(图4)。由图4-A可知，对甲醇添加量分别按0.5%，1%，1.5%(体积分数)进行优化，随着诱导时间延长，重组抗菌肽蛋白表达质量浓度逐渐升高，甲醇添加量(体积分数)0.5%，诱导时间96 h，出现蛋白表达量峰值0.042 g/L。甲醇添加量(体积分数)为1%时整体趋势和添加量(体积分数)为0.5%较为相似。而甲醇添加量(体积分数)为1.5%时，在诱导的前48 h蛋白浓度较高，超过48 h以后蛋白浓度开始下降，可能是甲醇浓度过高对细胞产生了毒害作用。分泌重组抗菌肽的抑菌活性分析(图4-D)，随着诱导时间延长，重组抗菌肽抑菌圈逐渐增大，甲醇添加量(体积分数)在0.5%，诱导时间72 h，抑菌圈最大，说明重组抗菌肽抑菌活性最强。

如图4-B所示，对BMMY培养基诱导过程起始菌体浓度进行优化，结果表明，起始菌体浓度越高则蛋白表达量相对较高，峰值出现在菌体起始浓度OD600为1.5，诱导72 h，蛋白表达量(质量浓度)为0.045 g/L。但在诱导72 h以后，蛋白表达量开始下降。起始菌体浓度优化的抑菌活性分析结果类似，起始菌体浓度越高则抑菌活性相对较高，抑菌圈峰值出现在菌体起始浓度OD600为1.5，诱导72 h(图4-E)。图4-C是对不同诱导温度进行优化，结果表明诱导温度28 ℃下蛋白表达量整体偏高，峰值出现在28 ℃诱导72 h，蛋白表达量(质量浓度)为0.056 g/L，随后蛋白质量浓度又逐渐下降。可能是和菌体老化相关。不同温度条件下的抑菌活性分析结果显示，28 ℃相比另外2个温度，抑菌圈相对较大，随着时间延长，抑菌圈增大，但在72 h后开始下降。抑菌活性峰值出现在28 ℃诱导72 h(图4-F)。对诱导条件优化综合分析，从蛋白表达量和发酵上清液的抑菌活性分析对诱导条件优化得到结果基本一致，在甲醇添加量(体积分数)0.5%，诱导菌体起始浓度OD600为1.5，温度28 ℃，转速180 r/min，诱导72 h，分泌蛋白表达量最高，且重组抗菌肽的抑菌活性最强。

A-甲醇添加量优化(蛋白表达量);B-起始菌体浓度优化(蛋白表达量);C-诱导温度优化(蛋白表达量)；D-甲醇添加量优化(抑菌圈直径);E-起始菌体浓度优化(抑菌圈直径);F-诱导温度优化(抑菌圈直径)图4 不同诱导条件下重组蛋白表达量及抑菌圈直径Fig.4 Expression of recombinant protein and antibacterial activity under different induced conditions

2.4 体外抑菌活性分析

为了检测重组抗菌肽的体外抑菌活性，用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌做指示菌，用琼脂孔穴扩散法进行抑菌活性分析。图5显示毕赤酵母分泌表达的抗菌肽对2种指示菌都有明显的抑菌圈，而转化空载体的酵母菌上清液对照没有抑菌圈，说明毕赤酵母转空载体本底水平分泌代谢产物没有抑菌活性，结果表明表达产物中主要是重组抗菌肽发挥抑菌作用，重组抗菌肽对革兰氏阴性和阳性菌均有良好的抑菌活性。

1-对照；2～4-重组蛋白A-大肠杆菌;B-金黄色葡萄球菌图5 重组抗菌肽体外抑菌活性分析Fig.5 Analysis of antibacterial activity of recombinant peptide in vitro

3 讨论

抗菌肽具有独特的杀菌机制和较好的理化性质,有望成为抗生素替代品，在药物研发以及农业、食品工业生产中都具有很广阔的应用前景。抗菌肽是多肽类活性物质，具有很强的抑菌活性。抗菌肽可以从生物中提取，但是提取率低，采用化学合成法成本较高，不适用于大规模生产。因此用基因工程的手段来生产抗菌肽成为首选方法[11-12]。毕赤酵母表达系统具有易于操作，遗传系统稳定及蛋白表达量高等优点，被广泛应用到抗菌肽的表达[13]。目前应用毕赤酵母表达系统已经实现了泥鳅抗菌肽[14]、重组抗菌肽LFcinB-W4[15]， 厚壳贻贝抗菌肽Mytilins[16]等的表达。本文通过基因工程的手段利用毕赤酵母密码子偏爱性设计出一种新型抗菌肽Temporin-SHf，通过构建pPIC9K-Temporin-SHf重组表达载体，转化到毕赤酵母中实现其分泌表达。

毕赤酵母系统通过乙醇氧化酶基因启动子(AOX1)，稳定表达外源基因。甲醇诱导的温度、甲醇添加量、诱导时间，起始菌体浓度等都会对抗菌肽的表达水平产生影响。抗菌肽cecropin A经过诱导条件优化，在体积分数为0.5%甲醇诱导，28 ℃发酵48 h分泌表达抗菌肽质量浓度最高，抑菌活性最强[17]。杂合肽LPCB在0.5%(体积分数)甲醇，温度25 ℃诱导72 h后，表达量最大[18]。抗菌肽DCD-1L在毕赤酵母SMD1168中表达最适表达时间为48 h，温度为28 ℃，pH值为6，甲醇诱导量为终含量(体积分数)0.5%，表达量最大[19]。28 ℃、250 r/min诱导培养，每24 h添加体积分数0.5%的甲醇，诱导时间120 h，抗菌肽MgJ表达量(质量浓度)可达11.9 mg/L[20]。本研究中对重组抗菌肽Temporin-SHf 诱导表达的时间、温度、菌体起始浓度、甲醇添加量(体积分数)进行优化。甲醇可以诱导外源基因表达，蛋白表达量及蛋白抑菌效果。结果表明，当甲醇终含量(体积分数)0.5%诱导72 h 重组蛋白含量和抑菌活性均为最优。甲醇过大可能对菌体产生毒害作用，造成分泌蛋白表达量下降。菌体起始浓度对外源蛋白质量表达存在正向关系，但在诱导72 h以后蛋白浓度下降，可能菌体出现老化影响了分泌蛋白表达。温度对于蛋白表达也有很大影响，毕赤酵母的最适生长温度在25～30 ℃，培养温度过高或过低都将显著影响其产物表达量。通过温度条件优化，结果显示28 ℃诱导杂合肽的蛋白表达量最高，抑菌活性最强。综合分析表明在甲醇添加量(体积分数)0.5%，诱导菌体起始浓度OD600为1.5，温度28 ℃，转速180 r/min，诱导72 h，分泌蛋白表达量(质量浓度)最高，达到0.056 g/L，分泌蛋白抑菌活性最强。分泌表达蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌都有明显的抑菌效果。

4 结论

通过基因工程的手段利用毕赤酵母密码子偏爱性设计出一种新型抗菌肽，构建pPIC9K-Temporin-SHf重组表达载体，转化到毕赤酵母中实现其分泌表达。在甲醇添加量(体积分数)0.5%，诱导菌体起始浓度OD600为1.5，温度28 ℃，转速180 r/min，诱导72 h，分泌蛋白表达量最高。分泌表达蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌都有明显的抑菌效果。