短小芽孢杆菌W-7 与甲霜灵锰锌对致病疫霉的 协同抑制作用

梁 娇，张聪颖，乔 柳，孟翠丽，蒋继志

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2. 邢台医学高等专科学校 基础医学部，河北 邢台 054000）

由卵菌致病疫霉(Phytophthora infestans) 引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中最为主要的病害，当前控制马铃薯晚疫病的方法主要有抗病育种、农业栽培及化学防治，其中化学防治见效最快，以双炔酰菌胺和甲霜灵等制剂的应用较为普遍。但随着农药长期过量使用，致病疫霉抗药性不断增强［1］，高抗菌株出现频率逐年增加，甚至在部分马铃薯产区高抗菌株已达到了100%，同时甲霜灵及其衍生制剂对环境、甚至对人类健康也带来了一定的危害［2］。 因此，如何既能减少甲霜灵等化学农药的用量又能促使马铃薯增产并提高产品质量，是当前马铃薯生产中受到格外关注的热点问题之一。已报道的一些研究结果表明，添加农药控失剂［3］、利用拮抗菌及其制剂［4］、将不同农药复配［5］、拮抗菌与根际微生物复配［6］、将不同拮抗菌复配［7］在抑制致病疫霉或温室、甚至田间防治马铃薯晚疫病均有一定的效果。此外，将生防菌与化学药剂按一定比例混合后防治黄瓜根结线虫病、辣椒疫病和蔬菜苗期立枯病等病害，均可显著减少农药的用量［8-10］。但迄今未见将生防菌与化学药剂按一定比例混合后抑制致病疫霉或防治马铃薯晚疫病的报道。本试验是在本研究室前期已连续10 年监测我国北方5 省区致病疫霉对甲霜灵抗性［11］及筛选获得了多株对致病疫霉生长和产孢有显著抑制作用的拮抗菌株的基础上［12-13］， 选择其中抑菌作用强（抑菌率为94.44%）、离体防病效果显著（防效为73.40%）、与其它拮抗菌配伍后能显著增加抑菌和防病效果的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）W-7［7，13］与马铃薯生产中使用频率较高的甲霜灵锰锌复配，探讨两者复配后对致病疫霉的协同抑制效果，为田间减少农药使用的同时更加高效地防治马铃薯晚疫病提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料和培养基

供试菌株：致病疫霉［Phytophthora infestans(Mont.) de Bary］ W101，为本研究室保存的标准菌株，黑暗保存在14 ℃培养箱；短小芽孢杆菌［Bacillus pumilus(Meyer and Gottheil)］ W-7，为本实验室采自黑龙江省讷河市田间马铃薯晚疫病病叶上分离纯化并鉴定，保存于4 ℃培养箱；马铃薯品种为费乌瑞它，购自保定市工农路果品批发市场。供试培养基为黑麦培养基（Rye）、LB 固体培养基（LB）及LB 液体培养基（LBL）。

1.2 甲霜灵锰锌与W-7 菌株的复配

以少量二甲基亚枫溶解含量为98%的甲霜灵锰锌原药为原液（广州植物龙生物技术有限公司），再以无菌水稀释成浓度分别为40、70、100、150、200 μg/mL 的药液；根据万安琪［13］的方法制备W-7菌株原液（1.85×108cfu/mL）；参考杨秀荣等［10］的方法检测甲霜灵锰锌与W-7 菌株复配的可行性，并做如下修改：在26 mL LBL 中分别加入1 mL W-7菌株原液和3 mL 不同浓度（40、70、100、150、200 μg/mL）的甲霜灵锰锌药液，使培养液中甲霜灵锰锌的终浓度分别为4、7、10、15、20 μg/mL，28 ℃振荡培养（120 r/min）48 h，以W-7 菌株原液单独培养48 h 为对照，培养液用无菌水稀释106倍后分别在LB 上涂布培养48 h 统计菌落数。

1.3 甲霜灵锰锌与W-7 不同体积比复配后抑制致病疫霉菌丝效果的测定

根据上述1.2 的结果，选择对W-7 菌株生长没有明显影响的最高甲霜灵锰锌浓度（15 μg/mL）与 W-7菌液原液以不同体积比复配，使其体积比为3∶1、 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，采用对峙培养法测定复配液 对致病疫霉菌丝的抑制作用，在致病疫霉菌饼两侧打孔，孔中分别加入上述不同复配液30 μL，以加入等体积单独振荡培养48 h 的W-7 菌液原液为对照1，等体积15 μg/mL 的甲霜灵锰锌药液为对照2，等体积LBL 为空白对照。20 ℃培养7 d 后统计结果，十字交叉法测量菌落直径计算抑菌率，同时挑取致病疫霉菌落边缘的菌丝在显微镜下观察，统计菌丝畸变率［12］。

1.4 甲霜灵锰锌与W-7 不同体积比复配后抑制致病疫霉孢子囊效果的测定

将甲霜灵锰锌与W-7 菌液原液不同体积比的复配液（体积比同1.3）与1 mL 致病疫霉孢子囊悬浮液按体积比1∶1 混合，以等体积W-7 菌液原液和甲霜灵锰锌药液（15 μg/mL）与孢子囊悬浮液混合分别作为对照1 和对照2，以等体积无菌水与孢子囊悬浮液混合作为空白对照。25 ℃黑暗条件下培养32 h，镜检300 个孢子囊，统计孢子囊畸变率及直接萌发率。

1.5 甲霜灵锰锌与W-7 复配液对马铃薯块茎切片的防病作用

制备马铃薯块茎切片（2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm），选择1.4 中适宜的复配液稀释20 倍后，取20 μL 均匀涂抹在切片表面上，2 d 后接种致病疫霉菌饼（直径7 mm），以涂抹等体积W-7 菌液为对照1，等体积甲霜灵锰锌药液（15 μg/mL）为对照2，等体积LBL 为空白对照，对照组均稀释20 倍，20 ℃黑暗保湿培养7 d，统计病情指数［14］。

以上试验每种处理设5 次重复，试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 甲霜灵锰锌与W-7 菌株的复配

将培养液在LB 上涂布培养后发现，单独培养W-7 菌株的对照菌落数为最多（185 cfu/mL），供试几种甲霜灵锰锌浓度下的菌落数均少于对照，其中以甲霜灵锰锌浓度为20 μg/mL 时的菌落数最少（145 cfu/mL），与对照达到显著性差异（P＜0.05），其它几种浓度的处理均与对照无显著性差异（图1）。以上结果说明加入0 ～15 μg/mL 的甲霜灵锰锌对W-7 菌体生长基本无影响，但加入过高浓度的甲霜灵锰锌对W-7 菌株的生长有一定抑制作用。

图1 不同浓度甲霜灵锰锌对W-7 菌株生长的影响Fig.1 Effect of different concentrations of metalaxyl mancozeb on W-7 strain growth

2.2 甲霜灵锰锌与W-7 不同体积比复配后对致病疫霉菌丝生长的抑制作用

为了充分发挥甲霜灵锰锌对病菌的抑制作用，选择2.1 中对W-7 菌株生长没有显著抑制作用的甲霜灵锰锌最高浓度（15 μg/mL）与W-7 菌液原液按照不同体积比进行复配，不同复配液对致病疫霉菌丝生长的抑制作用如图2 所示，两者体积比为1:2时对菌丝生长的抑制率达到98.94%，显著优于其他几种复配液的抑制作用，尤其是与W-7 菌液单独处理的对照1（93.76%）之间达到显著性差异（P＜0.05），与甲霜灵锰锌单独处理的对照2（3.26%）之间达到极显著差异（P＜0.01）。两者复配后对致病疫霉菌丝体生长的抑制率高于两者单独处理的抑菌率之和，表明W-7 菌株与甲霜灵锰锌复配后在抑制菌丝生长方面发挥了增效作用。

图2 甲霜灵锰锌与W-7 菌液原液不同体积比复配对致病疫霉菌丝生长的抑制作用Fig.2 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volumes on mycelial growth of P. infestans

2.3 甲霜灵锰锌与W-7 不同体积比复配后对致病疫霉菌丝体形态的影响

挑取受甲霜灵锰锌与W-7 复配液抑制的菌落边缘的菌丝体（图3），镜检发现菌丝体有弯曲、内含物分布不均匀、内含物外泄等畸变状态，其中仍以霜灵锰锌与W-7 以体积比为1:2 复配时的菌丝畸变率最高（48.56%），显著高于其他复配处理 （P＜0.05），与W-7 菌液单独处理的对照1（33.23%）和甲霜灵锰锌单独处理的对照2（6.44%）之间均达到极显著差异（P＜0.01）。两者复配处理后所导致的菌丝畸变率明显高于两者单独处理的畸变率之和，表明W-7 菌株与甲霜灵锰锌复配后在菌丝致畸方面发挥了增效作用。

图3 甲霜灵锰锌与W-7 菌液原液不同体积比复配 对致病疫霉菌丝体形态的影响Fig.3 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volumes on mycelial form of P. infestans

2.4 甲霜灵锰锌与W-7 不同体积比复配后对致病疫霉孢子囊直接萌发的影响

将甲霜灵锰锌与W-7 的复配液与致病疫霉孢子囊混合培养后，镜检发现孢子囊的直接萌发率均显著低于空白对照（图4），其中以体积比为1:1 进行复配时孢子囊直接萌发率最低（5.87%），其次为体积比为1:2 的处理（6.32%），这2 种处理之间无显著性差异，但这2 种处理均显著低于W-7 单独处理（9.12%），也显著低于甲霜灵锰锌药液的单独作用（14.24%）以及空白对照（23.51%）（P＜0.05）。两者复配后的孢子囊萌发率大约为W-7 单独处理的2/3，是甲霜灵锰锌药液单独处理的1/3，表明W-7菌株与甲霜灵锰锌复配后在抑制孢子囊直接萌发方面发挥了协同作用。

图4 甲霜灵锰锌与W-7 菌液不同体积比复配对 致病疫霉孢子囊直接萌发的影响Fig.4 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volumes on sporangia direct germination of P. infestans

2.5 甲霜灵锰锌与W-7 不同体积比复配后对致病疫霉孢子囊畸变的影响

甲霜灵锰锌与W-7 的复配液不仅显著降低致病疫霉孢子囊的直接萌发，且导致孢子囊的形态发生畸变（图5），其中两者以1∶1 体积比复配后导致的孢子囊畸变率最高（54.36%），其次为体积比为1∶2 的处理（53.88%），这2 种处理之间无显著性差异，但这2 种处理均与W-7 单独处理（40.94%）之间达到了显著性差异（P＜0.05），尤其是与甲霜灵锰锌单独处理（18.39%）之间达到了极显著差异（P＜0.01）。两者复配后所导致的孢子囊畸变率与两者单独处理的孢子囊畸变率之和十分相近，表明W-7 菌株与甲霜灵锰锌复配后在引起孢子囊畸变方面发挥了协同作用。

图5 甲霜灵锰锌与W-7 菌液不同体积比复配对致病疫霉 孢子囊畸变的影响Fig.5 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volume on sporangia deformation of P. infestans

2.6 甲霜灵锰锌与W-7 复配在马铃薯块茎切片上的协同防病作用

甲霜灵锰锌与W-7 菌液原液复配液对晚疫病的防病效果如图6 所示，LBL 对照及甲霜灵锰锌对照切片表面菌丝体生长旺盛，几乎整个切片都被菌丝体覆盖，且表面变色严重，切开可见大部分组织变色发黑；W-7 对照切片表面菌丝体稀疏，变色面积较小，切开后未变色；而涂抹复配液的切片表面几乎无菌丝体，且变色面积较小，切开后也未见变色现象。复配液处理后的病情指数及防病效果与W-7、甲霜灵锰锌单独处理之间存在显著性差异（P＜0.05）。复配后的防效显著高于两者单独处理后的防效之和，表明W-7 菌株与甲霜灵锰锌复配后在马铃薯块茎切片上发挥了协同增效作用。

图6 甲霜灵锰锌与W-7 菌液复配在块茎切片上的防病效果Fig.6 Protection effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain on potato tuber slices infected by P. infestans

3 讨论

近年来，由于长期使用化学农药防治马铃薯晚疫病，致病疫霉抗药性逐年增加，加之农药对人体有一定危害，因此寻找如何在使用农药时达到减施增效的途径或措施迫在眉睫。虽然目前已经筛选获得了许多能显著抑制致病疫霉生长及产孢，并且在离体组织和温室中防病效果显著的一些拮抗菌［3］，但拮抗菌田间防效还不稳定，制约了其进一步研究和开发利用［4］。杨秀荣等［10］研究表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B579 与多菌灵复配后，对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）菌丝生长的抑制率达到77.80%，显著高于单独施用生防菌（33.30%）或多菌灵（50.20%）的处理；孙雪莹［15］报道生防菌枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和氟唑菌苯胺复配后，对番茄茎基腐病菌（R. solani）菌丝生长的抑制率最高为68.70%，高于菌悬液单剂（66.30%）和药剂单剂（63.33%）；段海明等［16］比较了生防菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）gfj-4 菌株的无菌体发酵液与咯菌腈、戊唑醇、苯醚甲环唑、多菌灵、腈菌唑和福美双6 种杀菌剂复配后对玉米茎腐病菌（Fusarium graminearum）的抑制作用，发现6 种杀菌剂分别与gfj-4 菌株发酵液复配后，对病菌菌丝生长均有显著的增效作用；Ji M 等［17］采用生长速率法测定了枯草芽孢杆菌DJ-6 与吡唑醚菌酯及其5 种配比对草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum）的室内抑制活性，结果显示100 μL/mL 枯草芽孢杆菌和100 μg/mL 吡唑醚菌酯单独处理后，病菌菌落直径分别为35.75 和16.00 mm，抑菌率分别为36.92%和77.44%，当两者分别以1∶1、1∶2、1∶3 和1∶4 等不同体积比复配后，病菌菌落直径均在10.00 mm 以下，抑菌率均在89%以上，两者复配后表现出了显著的增效作用。但迄今为止，将生防菌与化学农药复配后抑制致病疫霉并防治马铃薯晚疫病尚未见报道。

本试验探讨了短小芽孢杆菌W-7 与甲霜灵锰锌之间的复配及其在防治马铃薯晚疫病方面的潜力，发现将甲霜灵锰锌药液与W-7 菌液原液复配后，对致病疫霉菌丝生长的抑制率均优于各自单独的处理，这与杨秀荣等［10］报道的枯草芽孢杆菌B579 与多菌灵复配抑制立枯丝核菌、孙雪莹［15］进行的枯草芽孢杆菌和氟唑菌苯胺复配抑制番茄茎基腐病菌、段海明等［16］研究的解淀粉芽孢杆菌gfj-4 菌株的无菌体发酵液与6 种杀菌剂复配后抑制玉米茎腐病菌的效果一致，生防菌与化学农药复配后对抑制病菌菌丝生长均有显著的增效作用，且本试验所得到的抑菌率均高于上述文献报道。此外，本试验探讨了W-7菌株菌液与甲霜灵锰锌对致病疫霉菌丝生长及孢子囊萌发的影响，结果显示W-7 菌液与甲霜灵锰锌以1∶2 体积比复配后的抑菌率最高，达到98.94%，显著高于两者单独处理的抑菌率之和，这与Ji M 等［17］研究报道的枯草芽孢杆菌DJ-6 与吡唑醚菌酯以不同体积配比后抑制草莓枯萎病菌菌丝生长的效果也基本一致，该试验中除了枯草芽孢杆菌DJ-6 与吡唑醚菌酯以1∶5 的体积比复配后的抑菌率略低于吡唑醚菌酯单独处理外，其它比例复配后的抑菌率均明显高于两者的单独处理，但该试验中复配后的抑菌率与单独处理之间的差异较小。除了将W-7 菌株菌液与甲霜灵锰锌以不同体积配比抑制致病疫霉菌丝生长和孢子囊萌发外，本试验还测试了复配液在马铃薯块茎切片上对晚疫病的预防效果，复配液处理后的防病效果（91.36%）显著高于两者单独处理后的防效之和（30.47%），这一结果明显优于杨秀荣等［10］将枯草芽孢杆菌B579 与多菌灵混配后防治蔬菜苗期立枯病的防效（87.30%），也显著优于刘合昌等［9］将甲霜灵和芽孢杆菌（Bacillussp.）B702 进行混配对盆栽辣椒疫病的防治效果（83.10%）。以上结果均表明，W-7 菌液与甲霜灵锰锌复配后在抑制致病疫霉菌丝生长和离体组织预防晚疫病方面均表现出了显著的协同或增效作用，显著优于两者的单独处理，甚至优于两者单独处理之和，暗示将两者复配在未来预防马铃薯晚疫病方面有较大的应用潜力。但使用该复配液预防马铃薯晚疫病尚未进行盆栽植株和大田试验，同时对于复配液中的生防菌在马铃薯植株上的定殖动态以及持效期也还不明确，这些问题均有待进一步研究。