代森锰锌液相色谱法成功晋升为CIPAC方法的历程与启示

宋俊华， 许 梅

(1.上海沈化院科技有限公司，上海 201210； 2.利民化学有限责任公司，江苏 新沂 221400)

由利民化学有限责任公司(以下简称“利民化学”)自主研发的代森锰锌液相色谱分析方法，在2019年德国布伦瑞克召开的第63届国际农药分析协作委员会(CIPAC)年会上顺利通过答辩，成功晋升为CIPAC方法。该方法自2016年提出申请，其间历经多次答辩，有效解决了多个技术难题，方法才得以完善。本文两位作者分别作为方法答辩人和开发者，亲身经历，感受良多，为此认真进行总结梳理，以为我国农药标准方法走向国际提供借鉴。

1 CIPAC方法申请背景

原代森锰锌FAO标准于老程序下建立(1980颁布)，俗称“老标准”。FAO现有类似“老标准”近200多个，但因其不能作为相同产品认定的首家，发挥不了国际标准应有的作用，为此2016年FAO制定了“老变新计划”及“更新优先列表”，代森锰锌被列入到第一批更新名单中。作为全球第二大代森锰锌生产和出口企业，利民化学在第一时间内提交了该产品标准的更新申请，但首先遇到的难题就是有效成分分析方法问题，老标准使用的代森锰锌分析方法(CIPAC 34/TC/M/- )为化学法，存在操作复杂，重复性差，在常规实验室不易开展，且还需使用高毒试剂等诸多缺陷。而CIPAC方法是申请FAO产品标准的第一步，申请标准首先需攻克CIPAC方法这一难题。

2 成功晋升CIPAC方法的艰难历程

常规分析方法要上升为CIPAC方法，需在全球近20家实验室进行方法的小范围及大范围验证(实验室间验证)，且验证结果需按照CIPAC要求的方法进行统计，并在CIPAC大会上汇报，在现场经受来自全球30多个国家质量管理实验室及行业实验室专家挑剔的目光考验，再由20多位国际专家组成的评审团评审通过后才能成为CIPAC方法，适用于全球农药质量监管。

代森锰锌仪器分析方法的难点在于其“难溶解、易分解”的特性。新方法采用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)络合法，在碱性条件下将代森锰锌溶解，采用液相色谱外标法定量，与原老化学分析法相比，该方法具有准确、简便、环保等诸多优点。

按照CIPAC程序要求，该方法首先于2016年在国内4家实验室完成了小范围验证试验，统计结果显示各项指标满意，并于同年在日本东京举办的第60届CIPAC会议上进行了汇报。随后CIPAC同意该方法进行下一步大范围验证试验，并在其网站上公布了大范围验证试验通知，先后有全球20多家实验室自愿报名参加。由于样品国际长途运输时间长、环境不可控、部分实验室对代森锰锌性质不熟悉等多种原因，在首次大范围验证试验中，国外多家实验室反映样品不易溶解或溶解后不稳定分解严重，导致在2017年第61届CIPAC会议上进行的首次大范围验证结果答辩未能获得通过。CIPAC要求对方法进行改进，并补充提交改进后方法的方法确认报告及溶液稳定性报告等。

为解决上述问题，针对代森锰锌产品本身的特性，利民化学改进了分析方法，通过增加环境温度控制(17℃)、降低柱温(15℃)，以及使用短柱减少分析时间等多种方式来保证溶液稳定性。改进后的方法按照CIPAC要求完成了方法确认报告，结果显示方法线性、准确度、精密度、回收率及溶液稳定性等各项指标合格，并于2017年通过CIPAC平台重新组织进行了大范围验证试验。

但在2018年召开的第62届CIPAC会议答辩时，该方法再次遇到了挑战，因代森锰锌化合物本身的特殊性及首次答辩时残余的对方法的不信任感，会议代表们对方法提出了诸多质疑，如：因方法为衍生化法，实际的分析物是什么？分析原理是什么？保留时间和红外光谱是否足以对分析物进行准确定性？既然验证试验所用标准物质来自利民化学，那么其含量是否准确，国际市场上是否有含量可靠的标准物质供应？17℃的环境温度对于大多数试验室来说，条件是否过于苛刻？最终因存疑问题过多，该方法被CIPAC评审委员会再次否决。

为解决上述问题，在查阅大量文献后，经交叉核实，确认了方法的分析原理。

即实际分析物为乙烯双二硫代氨基甲酸(EBDC)离子。对于方法定性不充分的问题，经与CIPAC协商确定，定性方法除了保留时间和红外光谱，再加上CIPAC MT 165 紫外吸收测试法，以准确区分代森锰锌和代森锰。针对17℃环境温度控制不够现实的质疑，通过多次尝试将环境温度调整到20℃，并重新在此条件行进行了溶液稳定性试验，直到试验结果显示稳定性数据合格为止。对液谱分析而言，定量准确来源可靠的标准物质是基石，但从Dr. Ehrenstorfer GmbH购得的代森锰锌标准物质含量只有70%多(代森锰锌含量越高越不稳定)，为了打消评委们的疑虑，利民化工将此标准品再次同时用化学法和液谱法进行了定量，以确认含量的准确性，结果显示Dr．Ehrenstorfer GmbH 70%的标准品含量可靠，可用于常规定量分析。

改进后的方法又一次在国内6家实验室和国外2家实验室进行了验证试验，并在2019年第63届CIPAC会议上再次答辩，在强大的证据支持下，该方法最终获得专家认可，经过2016-2019的4年艰辛历程，利民化学的代森锰锌液相色谱法成功晋升为CIPAC方法。

3 方法提要

在小于20℃环境温度下，试样用缓冲液B溶解，以甲醇和缓冲液A为流动相，使用以Agilent Extent C18为填料的液相色谱柱(色谱柱pH值耐受范围为2.0～11.5)和紫外检测器，在282nm处，对试样中的代森锰锌进行高效液相色谱分离，外标法定量。

典型色谱操作条件：流动相： (甲醇+缓冲溶液A)=30+70(V/V) ， 经滤膜过滤；柱温：15℃；检测器波长：282nm；流速：1.0mL/min；进样体积：5.0 μL；保留时间：约7.8min。

缓冲溶液A制备：称取乙二胺四乙酸(EDTA)3.72g、磷酸氢二钠1.42g、四丁基硫酸氢铵3.39g溶于1 000mL的水中，用饱和氢氧化钠溶液调pH值至10.0。超声混匀后用0.22μm膜过滤，备用。

缓冲溶液B制备：称取EDTA 7.44g、磷酸氢二钠1.42g、四丁基硫酸氢铵3.39g、亚硫酸钠3g溶于1 000mL的水中，用饱和氢氧化钠溶液调pH值至11.0。超声混匀后静置30min，备用。

4 成功申请CIPAC方法的意义及启示

4.1 为下一步成功申请FAO标准打好前站 CIPAC方法是申请FAO标准的第一步，《FAO/WHO农药标准制定和使用手册》第2.9部分明确提到：FAO和WHO标准中使用的农药原药和制剂有效成分的检测方法，都要经过CIPAC和AOAC协同验证与认可，其中90%以上来自于CIPAC认可的方法。成功晋升CIPAC方法为下一步申请代森锰锌FAO标准打好了前站。

4.2 为利民化学代森锰锌走向世界奠定了基础 FAO标准是全球认可的鉴别同一药剂不同产品质量好坏的通用标准，可为产品质量背书，获得国际机构和专家对其免费的宣传，更加便捷的竞标联合国和有关政府、公益组织的采购项目，是产品走向国际市场的通行证和敲门砖。代森锰锌CIPAC方法和FAO标准必将成为利民化学开拓国际代森锰锌市场可用的两张响当当的名片。

4.3 解决了全球代森锰锌产品因分析方法导致的质控难问题 代森锰锌老方法存在操作复杂，重复性差，在常规实验室不易开展，且还需使用高毒试剂等诸多缺陷。新方法虽历经多次答辩，但CIPAC一直没有放弃，继续给与利民化学不断完善的机会，就是因为他们也需要一个更加方便快捷的代森锰锌CIPAC方法供全球代森锰锌产品质量控制之用，从另一个角度看，利民化学帮助CIPAC解决了这个难题。

4.4 对开展CIPAC全球验证试验的体会 从利民化学申请代森锰锌CIPAC方法的历程来看，除了方法开发本身，方法的申请者还需要重点关注

以下环节：CIPAC全球验证试验需要在CIPAC官网上发出通知，并明确参加实验室数量要求，实验室数量的确定既要考虑实验成本也需兼顾统计结果的可靠性；寄送试验样品及标样前需了解目的地国家试验样品管理政策，以避免寄送时间过长导致样品分解等，必要时可向CIPAC求助出具“试验样品证明”；试验报告模板要求应明确，以有利于试验完成后的数据统计，并要求实验室提供部分原始数据以备试验结果出现问题后有据可查；试验过程中保持与实验室的沟通，跟踪试验进程，对实验室提出的问题进行及时答复；试验结果统计过程中对出现的离群值或歧离值不能随意剔除，需提供确凿的证据支持。