AHLs类信号分子对IFFAS工艺影响研究

徐 嘉 蔚， 刘 涛

( 大连理工大学 环境学院, 辽宁 大连 116024 )

0 引 言

生物膜与活性污泥复合工艺在工业和城市污水处理中的应用已有20多年的历史[1]．该工艺兼具生物膜法和活性污泥法的优势，如对污染物处理能力强、抗冲击负荷能力强、传质效率高[2-3]等，还能克服两种工艺的弊端[4]．生物载体是该工艺的核心部分，其主要特点在于能够维持反应器内较高的生物量浓度[5]．同时，相比固定式生物载体，可移动的悬浮生物载体具有更优越的性能，而基于悬浮生物载体的生物膜与活性污泥复合(integrated floating fixed-film activated sludge，IFFAS)工艺受到了广泛的关注．

但IFFAS工艺普遍存在启动周期长的问题，这主要是由于传统载体材料(如聚乙烯(PE)、聚丙烯)的生物亲和性差，使得生物膜在载体表面的形成速度慢，从而导致工艺启动较慢[6]．因此，开发新型载体以促进微生物在载体表面的生长具有重要的现实意义．目前，对载体材料改良的主要方向是改变载体表面的理化性能．如向制备载体的原料中添加具有亲水性的功能料以及具有正电荷性的功能料以改善微生物在载体表面的附着效果，或向原料中引入功能基团(羰基等)以加速电子传递[7]．本课题组前期对载体亲水亲电性能的改性做了一系列的研究[7-9]，研究结果表明，改性载体较传统载体具有更快的挂膜速度，其反应器具有较强的污水处理能力，但载体表面的生物膜不稳定、易脱落的现象仍然存在，因此，提高生物膜的稳定性对污水处理有重要意义．

在以往的实验过程中发现，生物膜在某一时间段会有生物膜量突增的现象，而最新的研究表明，微生物的聚集行为不仅取决于环境条件，还取决于微生物间的一种被称为群体感应(quorum sensing，QS)的效应[10]．所谓群体感应，是指微生物向环境中释放某些物质(信号分子)，其能够在细胞间进行自由扩散，并随着细胞密度的增加，信号分子浓度也不断积累，当达到一定阈值后，信号分子会进入微生物细胞内诱导相关基因的表达，从而起到调控菌群的生态关系以及生理行为的作用[11]．迄今为止，由N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine-lactones，AHLs)类信号分子介导的QS被证明是参与生物膜形成和生长的重要QS系统之一[12-13]．随着对QS系统更加深入的研究，通过人为干预QS来调控细菌生理行为的方法受到了关注．有研究表明，向生物膜工艺中添加适当适量的AHLs类信号分子，不仅能够增加生物膜表面的生物量，还能够改善系统处理效果[14-15]．此外，硝化细菌、厌氧氨氧化细菌以及反硝化细菌等水处理中重要的脱氮菌都被发现与QS密切相关[16-18]．

基于此，本研究通过向IFFAS系统中投加改性载体以及一定量的AHLs类信号分子，与活性污泥系统、投加传统载体的IFFAS系统以及添加改性载体的IFFAS系统对比，考察在改性载体和群体感应共同作用下的IFFAS工艺的挂膜效果和水处理效果，以期通过将群体感应作用与改性载体协同，调控功能菌群，提高系统的挂膜速度并强化系统的污水处理能力，为IFFAS工艺的推广应用提供理论依据．

1 实验与方法

1.1 改性载体的制备

本研究所使用的改性载体和聚乙烯传统载体均自主生产．改性载体的改性功能料为聚季铵盐-10(PQAS-10)(2%，亲水性、亲电性)、斜发沸石(2%，氨吸附性)和滑石粉(1%，质量控制)．将经机械搅拌混匀的原料投入单螺杆挤出机，经模具挤出成型，该过程中进料阶段、熔融阶段、混合阶段和挤出阶段的筒区温度分别为125、135、145、120 ℃．两种载体均为中空圆柱体，表面竖向伸展“鳍”，内部有十字支撑，直径和高均为10 mm，平均比表面积约为600 m2/m3．

1.2 实验装置与操作方法

1.3 分析方法

1.4 AHLs类信号分子的检测

由于体系中AHLs的浓度很低，测试前需要进行浓缩．参照Wang等[26]的研究，利用固相萃取技术(SPE)对样品进行1 000倍浓缩．SPE所用仪器为全自动固相萃取仪(AT-280)，固相萃取柱为HLB(6 mL，Waters Oasis)，活化剂为甲醇和水，洗脱剂为甲醇．

采用液相色谱-四级杆质谱联用仪(Agilent RRLC/6410)测量AHLs，根据胡惠秩[27]的研究和实际条件，确定超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)的参数，色谱条件为C18色谱柱(直径4.6 mm，长度150 mm，填料粒径5 μm)，色谱分离流动相：A为含有0.1%甲酸的超纯水，B为含有0.1%甲酸的乙腈，流速0.25 mL/min梯度分离(乙腈30%开始到60%止)，进样量为20 μL，保持柱温40 ℃．质谱条件为ESI(+)电喷雾离子源，多反应离子监测模式(MRM)，脱溶剂气温度为300 ℃，离子源温度为100 ℃，去溶剂气氮气流速8 L/min．

1.5 载体表面生物膜形态表征

将载体切割成条状样品，再对载体表面成熟期生物膜进行固定、清洗、脱水、干燥、镀金等预处理，后采用扫描电子显微镜(Hitachi S4800，日本)观察生物膜形貌．

1.6 微生物群落结构分析

采集反应器中污泥和载体表面生物膜样品，参照说明书(OMEGA试剂盒)提取样品中的DNA，利用V4V5区引物(前端引物515F-5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；后端引物907R-5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′)对样品中的16S rRNA基因进行PCR扩增，采用欧易生物的Illumina Miseq测序仪(Illumina 2000)进行高通量测序(high throughput sequencing，HTS)，再通过Trimmomatic、QIIME(split_libraries)等软件进行微生物群落结构分析．

2 结果与分析

2.1 生物膜生长情况

2.1.1 生物膜量的变化 生物膜在载体表面的形成可以看成是载体表面生物膜量的固定过程．微生物在载体表面的固定一般分为3个过程：微生物在水力作用下向载体表面迁移过程、可逆附着过程和不可逆附着过程[28]．每个过程的生物膜增长速率有一定的差异．本实验R2、R3、R4生物膜量Q在生物膜形成过程中的变化如图2所示．在反应器启动初期(2周)，3个反应器内载体表面的生物膜量略有增长(2周内3组反应器生物膜量不超过1 g/m2)，说明该时期的微生物处于对新环境的适应阶段．在第4至10周生物膜量一直处于增长状态，说明该时期是生物膜快速形成的活跃期．在第10周之后生物膜量基本保持稳定(较第2周增加了300%以上)，说明此时生物膜基本成熟．

在生物膜的形成过程中，3组反应器中载体表面生物膜量呈线性增长趋势，R2、R3、R4反应器中载体表面的生物膜量平均周增长速率分别为0.34、0.44、0.46 g/(m2·周)．显然，改性载体表面生物膜量增长速率明显大于传统载体．当生物膜量稳定时，R2的生物膜量为3.28 g/m2，相比而言，改性载体表面生物膜量分别为4.33 g/m2(R3)和4.57 g/m2(R4)，说明改性载体能够显著提高载体表面生物膜量，这主要归因于改性载体表面生物亲和性的改善．而添加AHLs类信号分子的R4中载体表面的生物膜量较R3略有提高，说明添加信号分子能够增强微生物在载体上附着生长的能力．

2.1.2 生物膜结构的变化 生物膜中不同种群细菌之间的交联主要和EPS有关，因此研究EPS在生物膜形成中的变化规律有助于考察生物膜结构[29]．EPS组成较复杂，主要为多糖和蛋白质，其比值(Qps/Qpn)能够反映生物膜特性．本实验R2、R3、R4载体表面的EPS在生物膜形成过程中变化如图3所示．

在挂膜过程中载体表面多糖和蛋白质含量变化规律表现为均在增长一段时间之后趋于平缓．当载体表面的多糖和蛋白质含量达到稳定阶段时，R3中载体表面的多糖和蛋白质略高于R2中的，说明改性载体相比传统载体能够增强生物膜的附着性和生物活性．而添加AHLs的R4反应器中载体表面的多糖和蛋白质含量明显高于R2、R3中的，能够达到0.34 g/m2(多糖)和1.38 g/m2(蛋白质)，分别是R2中载体表面的2.21倍和1.43倍，是R3中载体表面的1.85倍和1.07倍．说明添加适量的AHLs类信号分子能够促使微生物分泌蛋白质和多糖，且其对多糖的促进作用高于蛋白质．

除此以外，有研究发现在生物膜的形成过程中，多糖和蛋白质对形成生物膜的作用不同，多糖能够起到黏附更多微生物的作用，而蛋白质则保证了生物膜的抗冲击能力，因此可以Qps/Qpn作为分析生物膜形成阶段的指标[30]．在该实验中，3组反应器中载体的Qps/Qpn随着生物膜的形成先达到峰值，并在第8周之后下降到一定水平并保持平缓．R3中载体的Qps/Qpn在前期比R2的高，在第10周与其基本一致，这可能是导致改性载体生物膜较传统载体生物膜生长快的因素之一．而添加一定量的信号分子后Qps/Qpn发生了明显的变化，R4中载体上的Qps/Qpn在生物膜形成前期(第4周)达到了较高水平，分别是R2和R3中载体的2.16倍和1.74倍，在稳定之后的Qps/Qpn仍比R2和R3高．这可能是由于外源信号分子对多糖分泌的影响比对蛋白质分泌的影响更显著，从而影响生物膜结构，该结果与胡慧秩的研究结果一致[27]．

2.1.3 AHLs浓度的变化 实现群体感应的信号分子种类很丰富，本研究选取了4种常见的AHLs类信号分子：C4-HSL、C8-HSL、3OHC12-HSL、C14-HSL．分别在反应器运行第4周和第14周时对4组反应器中的AHLs含量进行定量．各阶段各反应器中信号分子浓度如图4所示．

在系统启动的第1～2周，微生物尚未适应新环境，活性较低，分泌的信号分子较少，而系统为连续流，使得信号分子难以累积，因此几乎所有AHLs信号分子浓度均低于检测线，难以定量．第4周之后，微生物已适应新环境，活性升高，分泌信号分子速率提高，系统中能够检测到AHLs并对其定量．第4周时，反应器中不同类型的AHLs含量有差异，未添加信号分子的反应器分泌的各类AHLs差异不大．第14周后未添加信号分子的系统内AHLs浓度较第4周略有上升，说明此时群体感应细菌活跃度较高，能更快地分泌信号分子；而R4中的C4-HSL浓度却比第4周时低，说明这个时期反应器内添加的C4-HSL多被细菌接收消耗，结合前文得出的添加信号分子能够改变生物膜结构的结论，被消耗的C4-HSL可能是影响生物膜结构的重要因素．

2.1.4 载体表面的微生物群落特征形貌 R2、R3、R4中载体表面的生物膜生长稳定后(第12周)，通过SEM观察，结果如图5所示．低倍镜下，R2中传统载体表面附着的生物膜块较小且稀疏，R3中改性载体表面附着的生物膜块较大且密集，而R4中改性载体表面附着的生物膜块不仅大而密集，且有部分重叠层．在高倍镜下观察时能够看出，R2中传统载体表面的微生物以杆菌和少量菌丝交联；R3中改性载体表面的微生物联结明显更加紧密，且除了杆菌还有较多球菌；而R4中改性载体表面的微生物形成的大团簇更加明显，细菌之间的联结更加紧密．以上结果表明，微生物在R4中的载体表面附着效果最好，推测可能为添加的信号分子起了较大的作用．

2.2 污染物去除效果

2.2.1 COD去除效果 由于国内生活污水碳氮比呈不断降低的趋势，为使出水总氮达标，通常会在处理过程中投加外加碳源，从而增加了处理费用．因此，本研究采用分阶段降低进水碳氮比的方式运行，以节省进水的碳源．第14周起，持续对4组反应器中的化学需氧量进出水浓度进行测定，COD变化情况如图6所示．

无论是高碳氮比(碳氮比为8，c(COD)=300 mg/L)还是低碳氮比(碳氮比为4，c(COD)=160 mg/L)的情况，溶解氧适中(c(DO)=(1.5±0.3) mg/L)或低(c(DO)=(0.8±0.3) mg/L)的情况，4组反应器的出水COD基本能达到国家一级A标准(50 mg/L)．随着进水碳氮比的降低，COD去除率略有降低．在低碳氮比时，投加了载体的反应器的COD平均去除率为81.2%～83.6%，高于仅有活性污泥的反应器(R1)的COD平均去除率(76.8%)，说明IFFAS工艺相比于活性污泥工艺更有助于去除污水中的COD，分析原因是由于载体能够富集较多的异养菌，异养菌活性较大，能够利用更多的COD．

在第2阶段，保持溶解氧不变，降低进水COD浓度以降低碳氮比到6，R4出水氨氮和总氮仍然很稳定，而其他反应器均出现了较大的波动，且R2和R3出水已不能达到国家一级A标准．这说明由于信号分子AHLs的加入，IFFAS系统能够保持较好的稳定性．与此同时，R2和R3反应器内出现了污泥膨胀的现象，其原因可能是曝气不稳定导致溶解氧在反应器内分布不均，形成部分区域溶解氧浓度过大，部分区域溶解氧浓度过小的情况，从而导致丝状菌大量繁殖引起污泥膨胀．因此在这个阶段之后降低溶解氧浓度并充分搅拌使反应器内部各个区域均保持在(0.8±0.3) mg/L．运行一段时间之后污泥膨胀现象消失，R3和R4氨氮出水浓度能够达到国家一级A标准，R4总氮出水浓度也能达到国家一级A标准．R1、R2、R3、R4的氨氮平均去除率分别为83.0%、85.7%、86.6%、94.8%，总氮平均去除率分别为48.0%、54.2%、55.9%、65.3%．显然，R4的氨氮和总氮去除效果明显优于其他3组反应器．分析原因，投加的改性载体较传统载体有更好的亲水性和亲电性，更有利于富集硝化菌和反硝化菌，且改性载体中的功能料天然沸石能够吸附氨氮，从而促进硝化菌快速生长[9]；而添加AHLs不仅能够改变载体表面生物膜结构，使其更有利于微生物的生长，同时，AHLs还能促进硝化和反硝化效果．因此，R4表现出更强的脱氮能力．

在第4阶段继续降低碳氮比为4．此时除R1外的3组反应器的出水氨氮浓度均能满足国家一级A标准，但出水总氮浓度有所上升．值得注意的是，R4的总氮去除效果较其他反应器好，去除率为58.8%，但较前三阶段有所下降．可能由于该条件下碳源较少，不能为反硝化提供足够的电子受体，从而导致了硝态氮和亚态氮的积累．

2.3 细菌群落分析

2.3.1 多样性 在研究不同条件下污染物去除效果的实验第4阶段结束后，对R1、R2、R3和R4中的悬浮污泥以及R2、R3和R4中载体表面的生物膜进行16S rRNA高通量测序后分析样本内细菌群落结构特征．其群落结构多样性以及丰富度指数如表1所示．本次测序覆盖率均达到99%以上，说明本次测序结果可靠．从每个样本中获得至少31 701个有效序列，7个样本可分别获得432～523个操作分类单元．Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数均能估算群落分布多样性．

表1 不同反应器中悬浮污泥和载体表面的微生物丰富度指数

由表1可得，R2、R3和R4中载体表面的微生物群落多样性均大于其反应器中悬浮污泥的，说明载体不仅能够富集更多的生物量，还能吸引更多的微生物种类在其上生长．传统载体和改性载体表面的微生物群落多样性差别不大，但添加AHLs后载体表面的细菌多样性却相对下降，结合其生物活性和污染物降解效果较强的结果，分析出现该现象的原因是受AHLs类群体感应调控作用的影响，载体表面某些功能菌的含量相对增加，而有一些细菌在实验过程中被淘汰．

2.3.2 细菌群落 从门水平分析，4组反应器中的悬浮污泥样品和载体表面生物膜样品中的优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，添加了AHLs的R4生物膜中的拟杆菌门比例比其他反应器中的高，但硝化螺旋菌门(Nitrospirae)却较低，分析原因可能是AHLs对拟杆菌门的影响比对硝化螺旋菌门的影响大．

从目水平下进一步分析细菌群落，将系统中的功能菌目分为6种类型，分类结果如表2所示．R3中的聚磷菌总占比明显高于R2，而R4中反硝化菌和聚磷菌的优势更加明显，这能够解释前文硝化速率变化与反硝化速率变化有差异的原因．说明改性载体的投加对反硝化菌的富集更有效果，而添加AHLs类信号分子能够强化反硝化菌的生长能力．且R4中的硝化菌比R3占比低，但污染物降解效果却仍有提升，说明添加AHLs类信号分子也能提高硝化菌的硝化效率．

表2 目水平功能微生物菌群及比例

从污染物降解的角度看，投加载体能够为不同细菌提供生长环境，改性载体能够促进微生物的挂膜生长，而添加AHLs类信号分子能够极大程度地提高一些反硝化菌的生长与活性．这对于IFFAS工艺利用改性载体和群体感应现象提高处理能力提供了新的思路．

3 结 语

相比于传统载体，添加改性材料的载体生物亲和性较好，载体表面生物膜量增长速率较快，生物膜生长稳定后载体表面生物膜量较高，在AHLs作用下的改性载体具有较高的蛋白质和多糖含量．改性载体和AHLs的共同作用，使得反应器具有更高的COD、氨氮和总氮去除效果，且对低碳氮比水质具有更好的适应性．此外，AHLs能够明显提高反硝化菌Zoogloea的相对丰度．