miR-1294对上皮性卵巢癌细胞增殖及细胞周期的影响*

郭桃英 ，徐海英 ，陈文娟 ，潘玫 ，吴谋喜 ，代翔

（1.江西省九江市妇幼保健院妇科，九江 332000；2.江西省妇幼保健院肿瘤科，南昌 332000）

卵巢上皮性癌 (epithelial ovarian cancer，EOC)是全球女性生殖细胞最常见的恶性肿瘤之一[1]，约占卵巢恶性肿瘤的90%，恶性程度高，病情发展快，患者的五年生存率约为30%-40%[2,3]。早期筛查有可能大大降低EOC的死亡率[4]。卵巢癌的发生、发展是一个复杂的过程，包括原癌基因的激活、抑癌基因失活等多种分子改变。研究发现，HER-2作为一种促癌基因,与转录因子EGR-1在卵巢癌的发生发展中起重要作用，对判断卵巢癌的预后有一定的指导意义[5]。因此，寻找新的生物学标志物以进行早期诊断和对其进行靶向治疗是非常必要的。

微小RNA（miRNA）是一种非编码RNA，在转录后水平影响靶基因表达[6]。miRNA通过细胞增殖、转移和侵袭影响癌症的发展[7]。近来有研究发现，miRNA-183的表达与癌症的预后相关，能调节癌细胞增殖以及提高抗肿瘤药物在EOC中的敏感性[8]。miRNA-100的表达降低和miRNA-203表达增加与EOC的进展及预后不良有关[9]。有研究报道，miR-1294已被发现为某些肿瘤中的肿瘤抑制因子，miR-1294通过直接调节TPX2抑制细胞增殖并增强神经胶质瘤对替莫唑胺的化疗敏感性[10]。miR-1294的表达下调能提高c-MYC表达，与食管鳞癌患者的预后不良有关[11]。目前有关miR-1294与上皮性卵巢癌的研究尚未见报道。本研究拟探讨miR-1294与上皮性卵巢癌细胞增殖能力的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞 培养 卵巢癌细胞株 SW626，A2780，SKOV3，OVCAR3及卵巢表面上皮细胞系（HOSEpiC）购于中国科学院上海生物科学所细胞库。脂质体Lipofectamine3000 Reagent购自美国Invitrogen 公 司 ，hsa-miR-1294mimics，hsa-miR-1294 inhibitor及mimics NC、inhibitor NC均由广州锐博生物科技有限公司合成和纯化。所有细胞在DMEM 培 养 基 （DMEM，Gibco，Gaithersburg，MD，USA）中培养，在37℃、含有5%CO2的加湿环境下 补 充 10%胎 牛 血 清（FBS，Gibco，Gaithersburg，MD，USA）。细胞贴壁生长，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化分散细胞，每3d传代一次。

1.2 qRT-PCR检测miRNA-1294的表达 根据使用说明，使用 Trizol试剂（TaKaRa，Dalian，China）提取总RNA。使用Prime Script RT Reagent试剂盒（Takara，Dalian，China） 加 入 1μg 总 RNA 合 成cDNA。 采用 SYBR Premix ExTaqTM II（TaKaRa，Dalian，China）对miR-1294的表达水平进行分析。使用ABI PRISM 7000序列检测系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA） 检测 miR-1294的表达。qRT-PCR的反应条件如下：95℃，10min，然后 95℃，5s；55℃，30s；72℃，30s，40 个循环。U6表达用作内对照。miR-1294的引物如下：miR-1294- 正 向 ：5'-TATGATCTCACCGAGTCCT-3'，miR-1294-反向：5'-TATGATCTCACCGAGTCCT-3'。使用2-ΔΔCt方法计算倍数变化。

1.3 细胞转染 根据以上实验结果，选取相对低表达miR-1294的细胞株SKOV3和OVCAR3，采用脂质体法转染细胞，转染mimics NC作为过表达的对照组，hsa-miR-1294mimics作为过表达组；转染inhibitor NC作为抑制对照组，hsa-miR-1294 inhibitor作为抑制组。使用相同体积的培养基转染Lipofectamine 3000作为空白对照组。转染8 h后，10%胎牛血清的DMEM换为无血清培养基，在37℃的CO2培养箱中培养48 h，qRT-PCR检测转染后卵巢癌细胞株的miR-1294表达情况。其值越高，表示该细胞株的miR-1294表达量越高。

1.4 CCK 8法检测细胞增殖实验 将转染后的SKOV3 和 OVCAR3（2×104/孔）细胞接种到 96 孔板中,37℃ 5%CO2继续培养24h,48h,72h和96h。随后,将CCK8溶液加入每个孔中并再陪育2h。使用微量滴定板读数器 （Tecan Infinite 200 PRO;Salzburg，Austria）检测细胞增殖,吸光度为 450nm。其吸光度越高表示细胞株的增殖率越高。

1.5 细胞周期分析 将转染48h后的细胞株SKOV3和OVCAR3及空白对照组细胞用于细胞周期分析。细胞在4℃，冰冷的70%乙醇中固定一整晚。然后用50g/L PI染色，50g/L RNase处理。使用流式细胞仪 （FACScan;BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分析细胞周期。

1.6 统计学处理 使用SPSS 17.0进行数据分析，研究结果数据表示为正态分布计量资料均数±标准差，组间差异采用两独立样本的t检验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞系中miR-1294表达量 qRT-PCR检 测 卵 巢 癌 细 胞 系 SW626，A2780，SKOV3 和OVCAR3及卵巢表面上皮细胞系 （HOSEpiC）中miR-1294的相对表达量，HOSEpiC细胞系相对表达量为 1.00883±0.25393，SW626细胞系相对表达量为0.62309±0.15175，A2780细胞系相对表达量为0.56157±0.12126,OVCAR3细胞系相对表达量为0.45055±0.09466；SKOV3细胞系相对表达量为0.4677±0.12181。miR-1294在卵巢癌细胞系SW626，A2780，SKOV3和 OVCAR3 中的表达明显低于卵巢表面上皮细胞系（HOSEpiC），且差异具有统计学意义(P<0.05，见图1)，这提示miR-1294可能在卵巢癌组织中发挥着重要的生物学功能。

图1 qRT-PCR验证卵巢癌细胞系及卵巢表面上皮细胞系（HOSEpiC）中miR-1294的表达

2.2 miR-1294对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响CCK-8检测结果显示，转染miR-1294 mimics后的OVCAR3细胞系及SKOV3细胞系增殖能力显著被抑制，在转染24h、48h及72h相比于空白对照组和mimics NC组，差异具有统计学意义。转染miR-1294 inhibitor后的OVCAR3细胞系及SKOV3细胞系24h、48h及72h相比于空白对照组和inhibitor NC组，能有效促进卵巢癌细胞的增殖活性 (P＜0.05，见图2、图 3)。

图2 cck-8法检测miR-1294对OVCAR3卵巢癌细胞增殖能力的影响

图3 cck-8法检测miR-1294对SKOV3卵巢癌细胞增殖能力的影响

2.3 miR-1294对卵巢癌细胞增殖周期的影响 流式细胞仪检测发现，转染miR-1294mimics的OVCAR3细胞系与miR-1294mimics NC组比较，其S期细胞平均比例分别为 (15.74±1.38)%和(27.61±2.59)%，G1期细胞比例分别为(69.11±3.28)%和(53.47±4.34)%。转染miR-1294mimics的OVCAR3细胞系S期细胞增殖指数较低，而停留在G1期的细胞比例则较高，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，见图 4)。 转染 miR-1294mimics的 SKOV3细胞系与空白对照组比较，其S期细胞平均比例分别为(15.37±0.91)%和(27.07±4.08)%，G1期细胞比例分别为 (69.09±2.05)%和 (54.02±3.20)%。转染miR-1294mimics的SKOV3细胞系的细胞S期细胞增殖指数较低，而停留在G1期的细胞比例则较高，差异有统计学意义(P<0.05，见图5)。

图4 转染miR-1294mimics对OVCAR3卵巢癌细胞周期的影响

图5 转染miR-1294mimics对SKOV3卵巢癌细胞周期的影响

3 讨论

卵巢恶性肿瘤具有异质性和多样性。发病率居妇科恶性肿瘤第三位，但死亡率最高。由于缺乏早期安全和无创的检测方法，患者一经发现多为晚期并提示高度恶性。因此，探讨其发病机制及寻找有效治疗方法至关重要。

近年来，有关EOC发生发展的潜在分子机制已经取得了显著的进步[12]。研究显示，细胞增殖抑制基因Mfn2上调可抑制卵巢癌细胞增殖[13]。更多研究发现MircroRNA可作为诊断和预后的生物学标志物。从肿瘤细胞侵袭转移方面研究发现，miRNA发挥重要抑癌基因或癌基因作用[14-16]，就组织敏感性、特异性、降解难易度及检测方便度来讲，mi R NA是 肿瘤早期诊断、肿瘤标志物及分子治疗靶向的研究方向[17,18]。在EOC进展中，miR-9通过靶向SDF-1/CXCR4途径起到上皮性卵巢癌细胞增殖的肿瘤抑制剂的作用[19]。miR-429的下调通过靶向ZEB1促进上皮性卵巢癌耐药性的发展[20]。MicroRNA-298通过调节EZH2的表达来抑制上皮性卵巢癌的恶性表型[21]。MiR-26b/KPNA2轴通过下调OCT4抑制上皮性卵巢癌的增殖和转移[22]。因此，这些证据表明，mircroRNA在EOC进展中起着至关重要的作用。但是，有关miR-1294在上皮性卵巢癌中的作用仍然未知。

在本研究中，我们以上皮性卵巢癌细胞系为研究对象，我们发现卵巢癌细胞株SW626，A2780，SKOV3和OVCAR3及卵巢表面上皮细胞系（HOSEpiC）中miR-1294均有表达，与HOSEpiC相比，SW626，A2780，SKOV3 和 OVCAR3 中的 miR-1294表达均较低。将miR-1294转染至SKOV3和OVCAR细胞后，细胞增殖情况测定显示，miR-1294过表达显著抑制细胞增殖能力。细胞周期分析显示，miR-1294的过表达导致S期细胞数量显著减少，而停留在G1期的细胞比例则较高，差异有统计学意义（P<0.05）。因此，上述结果表明增加miR-1294表达能抑制EOC细胞生长。

综上所述，miR-1294在上皮性卵巢癌的增殖与进展中发挥着某些调节作用，这为探索上皮性卵巢癌的发病机制以及寻找新的基因治疗靶点提供了依据。